雙花千里光總黃酮的提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性*

韓賀東，胡海清，林燕，陳練紅，王曉玲

(西南民族大學(xué)少數(shù)民族藥物研究所，四川 成都，610041)

藏藥雙花千里光(Senecio dianthusFranch. )主要分布于我國西藏、四川和云南［1］，具有祛風(fēng)除濕、清熱解毒等特效［2－3］?！恫厮幹尽酚涊d其主要用于治療傷口發(fā)炎、腫脹、急性結(jié)膜炎、皮炎、跌打損傷等癥［4］。千里光屬植物種類繁多，其主要成分有吡咯里西定類生物堿(pyrrolizidine alkaloids，PAs)及呋喃雅檻藍(lán)型倍半萜(furoeromophilanes)，另外還含有黃酮及揮發(fā)油［5－7］。本實驗以總黃酮含量為指標(biāo)，采用正交實驗優(yōu)選雙花千里光提取工藝。人體內(nèi)的羥自由基是一種氧化能力很強(qiáng)的活性氧分子，對人的機(jī)體危害很大［8］，本實驗對雙花千里光總黃酮粗提物的抗氧化活性進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)其具有良好的清除羥基自由基能力。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

SHB－3 循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;UV－1901 紫外分光光度計，北京普析通用儀器公司;AE 240 電子天平，瑞士Metter Toledo 公司;W201 恒溫水浴鍋，上海申生科技有限公司;GHG－9240A 型 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精密實驗設(shè)備有限公司。

1.2 試藥

藏藥雙花千里光采自西藏拉薩，經(jīng)西南民族大學(xué)劉園教授鑒定為菊科千里光族(Senecioncea)千里光屬植物雙花千里光(Senecio dianthusFranch. )。蘆丁由本實驗室制備，其結(jié)構(gòu)經(jīng)質(zhì)譜、紫外、紅外、核磁共振譜等波譜進(jìn)行表征，純度大于99.5 %，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 實驗方法

2.1 總黃酮含量的測定

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品12.0 mg，置于50 mL 容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液備用。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取對照品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置于25 mL 量瓶中，分別加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO21 mL，搖勻，靜置6 min，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的Al(NO3)31 mL，搖勻，靜置6 min，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaOH 試液10 mL，用體積分?jǐn)?shù)70% 乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min 后，以提取液作為參比溶液，按照紫外-可見分光光度法(中國藥典2005 年版一部附錄V A)，在510 nm 波長處測定吸光度。以吸光度對溶液濃度進(jìn)行回歸分析，結(jié)果濃度在0.0190 ～0.0480 mg/mL 內(nèi)呈良好線性關(guān)系?；貧w方程為Y=10.564X+0.0052，R2=0.999 1。

2.1.3 總黃酮含量的測定

取提取液1 mL，按2.1.2 方法顯色、測定，計算總黃酮含量，空白組為不加顯色劑的提取液，其余操作相同。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素實驗結(jié)果及正交實驗

3.1.1 不同提取溫度對雙花千里光總黃酮含量的影響

準(zhǔn)確稱取1 g 干燥雙花千里光粗粉，加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇20 mL，不同溫度下提取1.5 h，提取1次。抽濾，用少量提取溶液洗滌，濾液定容至100 mL容量瓶中，取0.5 mL 于25 mL 容量瓶，按2.1.2 方法顯色，定容，測定總黃酮含量。不同溫度對雙花千里光總黃酮含量的影響如圖1 所示。50 ～80 ℃總黃酮含量隨溫度上升而增加，溫度超過80 ℃總黃酮含量呈下降趨勢，可能是由于溫度太高而造成黃酮氧化分解［11］。因此，確定適宜提取溫度為80 ℃。

圖1 提取溫度對雙花千里光總黃酮含量的影響Fig.1 Influence of temperature on the yield of total flavonoids in Senecio dianthus Franch

3.1.2 提取時間對雙花千里光總黃酮含量的影響

準(zhǔn)確稱取1 g 干燥雙花千里光粗粉，加入70%乙醇20 mL，80 ℃分別下提取0.5，1，1.5，2，2.5 h，提取1 次。抽濾，用少量提取溶液洗滌，濾液定容至100 mL 容量瓶中，取0.5 mL 于25 mL 容量瓶，按2.1.2方法顯色，定容，測定總黃酮含量。不同提取時間對雙花千里光總黃酮含量的影響如圖2 所示。0.5 ～2 h 總黃酮含量隨提取時間上升而明顯增加，2 h 之后呈下降趨勢，可能是由于提取時間過長導(dǎo)致黃酮分解［12］。因此，確定適宜提取時間為2 h。

圖2 提取時間對雙花千里光總黃酮含量的影響Fig.2 Influence of extraction time on the yield of total flavonoids in Senecio dianthus Franch.

3.1.3 乙醇濃度對雙花千里光總黃酮含量的影響

準(zhǔn)確稱取1 g 干燥雙花千里光粗粉，加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇20 mL，80 ℃下提取1.5 h，提取1 次。抽濾，用少量提取溶液洗滌，濾液定容至100 mL 容量瓶中，取0.5 mL 于25 mL 容量瓶，按2.1.2 方法顯色，定容，測定總黃酮含量。不同乙醇濃度對雙花千里光總黃酮含量的影響如圖3 所示。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮含量先增長后減少，因此，確定適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

圖3 乙醇濃度對雙花千里光總黃酮含量的影響Fig.3 Influence of ethanol concentration on the yield of total flavonoids in Senecio dianthus Franch.

3.1.4 液固比對雙花千里光總黃酮含量的影響

準(zhǔn)確稱取1 g 干燥雙花千里光粗粉，加入不同體積的70%乙醇，80 ℃下提取1.5 h，提取1 次。抽濾，用少量提取溶液洗滌，濾液定容至100 mL 容量瓶中，取0.5 mL 于25 mL 容量瓶，按2.1.2 方法顯色，定容，測定總黃酮含量。不同液固比對雙花千里光總黃酮含量的影響如圖4 所示。隨著液固比的增加，總黃酮含量逐漸升高，當(dāng)液固比超過25:1 后，總黃酮含量幾乎不再增加。因此，確定適宜的液固比為25 ∶1(mL∶g)。

圖4 液固比對雙花千里光總黃酮含量的影響Fig.4 Influence of material fluid ratio on the yield of total flavonoids in Senecio dianthus Franch.

3.2 正交實驗

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選取影響雙花千里光總黃酮含量的4 個因素:提取溫度(A)、提取時間(B)、液固比(C)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(D)作為考察因素，因素水平安排見表1。每個因素設(shè)定3 個水平，按L9(34)表安排實驗，并計算總黃酮含量。實驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 雙花千里光總黃酮含量正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal test for total flavonoids in Senecio dianthus Franch.

表2 雙花千里光總黃酮含量正交實驗結(jié)果Table 2 Results of the orthogonal design for total flavonoids in Senecio dianthus Franch.

表3 雙花千里光總黃酮含量方差分析Table 3 Results of variance analysis for total flavonoids in Senecio dianthus Franch.

實驗結(jié)果表明，影響藏藥雙花千里光總黃酮含量的因素順序為:提取溫度＞乙醇濃度＞液固比＞提取時間。確定最佳提取工藝條件為:A3B2C3D3，即:提取溫度為90 ℃，提取時間為2 h，液固比為30:1 mL/g，乙醇濃度為70%。對優(yōu)選出的工藝條件進(jìn)行驗證，按照優(yōu)選的工藝條件，重復(fù)測定3 次，總黃酮含量平均值為14.27%，RSD 為0.46%。表明該工藝合理可行。

3.3 抗氧化活性的測定結(jié)果

3.3.1 雙花千里光總黃酮粗提物還原能力

根據(jù)Fenton 反應(yīng)原理及參考文獻(xiàn)［13］，在10 mL試管中分別加入不同濃度(0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL)的雙花千里光總黃酮溶液2.5 mL，再加入2.5 mL 磷酸緩沖溶液(0.2 mol/L，pH =6.6)和2.5 mL 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的鐵氰化鉀溶液，置于50 ℃反應(yīng)20 min，快速冷卻，取出試管后立即加入2.5 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸溶液，混勻后離心，吸取上清液2.5 mL 于具塞管中，隨即加入2 ml 蒸餾水，0.5 mL 的0.1%三氯化鐵溶液。搖勻，靜置后以水為對照，在700 nm 處測定其吸光度，每個濃度平行做3次，取其平均值。雙花千里光總黃酮粗提物的還原能力如圖5 所示。隨著濃度的增加，總黃酮粗提物和Vc 的還原能力都逐漸增強(qiáng)，但總黃酮粗提物的還原能力要弱于Vc。

圖5 雙花千里光總黃酮粗提物還原能力測定Fig.5 The reducing capacity of total flavonoids in Senecio dianthus Franch.

3.3.2 雙花千里光總黃酮粗提物對羥自由基( ·OH) 的清除作用

［14－15］，在10 mL 試管中依次加入6 mmol/L 的FeSO4的溶液1 mL，不同濃度(0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL)的總黃酮溶液1 mL，6 mmol/L 的H2O2溶液1 mL，搖勻，靜置10 min，再加入6 mmol/L 的水楊酸溶液1 mL，搖勻，靜置30 min。以水為對照，于510 nm 處測定器吸光值。清除率的計算公式:

清除率/% =［1 －(A1－A2)/A0］×100

式中:A0，用水代替總黃酮溶液測得的吸光度;A1，不同濃度總黃酮溶液的吸光度;A2，用水代替水楊酸時不同濃度的總黃酮下測得的吸光度。

雙花千里光總黃酮粗提物對羥自由基(·OH)的清除作用如圖6 所示。隨著濃度的增加，總黃酮粗提物和Vc 對羥自由基(·OH)的清除能力都逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度大于0.03 mg/mL 時，總黃酮粗提物對羥自由基(·OH)的清除能力要強(qiáng)于Vc，清除率均高于65%，具有良好清除羥自由基(·OH)的能力。

圖6 雙花千里光總黃酮粗提物對羥自由基(·OH)的清除能力Fig.6 The·OH clear capacity of total flavonoids in Senecio dianthus Franch

參 考 文 獻(xiàn)

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