配合物［Cd(phen)2O2］的結(jié)構(gòu)及其與脫氧核糖核酸(DNA)的相互作用

張 董， 姚 泉， 李梅瑜， 高恩軍

(1.沈陽化工大學(xué)應(yīng)用化學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽 110142;2.沈陽市無機分子基材料化學(xué)(國際)重點實驗室，遼寧沈陽 110142)

自順鉑出現(xiàn)以來，人們己經(jīng)合成出數(shù)千種鉑化合物，并研究了它們的抗腫瘤性質(zhì).以細胞為理論依據(jù)的傳統(tǒng)思路及工作方法正在受到?jīng)_擊，抗癌(腫瘤)藥物研究的范圍正在大大擴展，非鉑過渡金屬抗癌(腫瘤)藥物的研究正在逐漸成為一個研究熱點.其中豐富多樣的過渡金屬配合物因其卓越的放射化學(xué)性質(zhì)、光化學(xué)性質(zhì)、生物化學(xué)性質(zhì)吸引了眾多的科學(xué)家投身到此類配合物的研究中.相關(guān)配合物的組成及結(jié)構(gòu)更是豐富多彩，包括氨基酸配合物、雜環(huán)配合物、Schiff堿配合物、二茂金屬配合物和雙核配合物、含碳硼烷的配合物等經(jīng)典和非經(jīng)典的金屬配合物.其中，以鄰菲啰啉(l，10-phenanthroline，phen)為代表的多吡啶過渡金屬配合物與DNA的作用已成為目前活躍的研究領(lǐng)域之一.本課題是構(gòu)筑金屬鎘(Ⅱ)和1，10-菲啰啉的配合物，表征其結(jié)構(gòu)，研究其生物活性及作用機理，為以后的工作提供一定的基礎(chǔ).

含有鄰菲啰啉的二羧酸類配體能夠完全或部分質(zhì)子化，能提供多種配位方式.鄰菲啰啉環(huán)既含有N配位原子，又有一定的剛性，能夠促進晶體的形成，羧基在限定的范圍旋轉(zhuǎn)，能從不同方向與金屬離子配位.鎘與1，10-菲啰啉所形成的二元或三元配合物在結(jié)構(gòu)與性質(zhì)上也有研究［1］.因此，為進一步探索此類化合物的生物活性，本文合成了一個單核鎘(Ⅱ)的1，10-菲啰啉配合物，并對它們與DNA的作用方式進行了初步探索.

1 實驗部分

1.1 實驗試劑及儀器

1，10-菲啰啉、硝酸鎘均為分析純;HC-DNA從本實驗室培養(yǎng)的 HeLa細胞提取;pBR322-DNA為生化試劑.

X-射線單晶衍射儀，Bruck smart 1000 CCD;紅外光譜儀，Nicolet FT-IR 470;元素分析儀，F(xiàn)innigan EA 1112;磁力攪拌器，D-MS-I;精密數(shù)顯酸度計，PHS-3C;電子分析天平，AR2140;復(fù)合電極，E-201-C pH;日立23010熒光光譜儀、上海JS380A自動凝膠圖像分析儀.

1.2 配合物的合成

稱取1，10-菲啰啉和 Cd(NO3)2·3H2O 一定量，各用10 mL蒸餾水溶解，用KOH調(diào)節(jié)pH值到接近中性后攪拌，在攪拌條件下反應(yīng)2 h，溶液過濾，得到無色透明液體，室溫下靜置3周后有無色粒狀晶體析出，得到固體配合物.

1.3 配合物的紅外光譜數(shù)據(jù)

σ，cm-1:3 425(m)，3 051(w);1 578(w)，1 622(w);1 384(s)，1 291(m);1 142(m)，1 102(m)，1 034(m);849(m)，729(s).

1.4 配合物的結(jié)構(gòu)

配合物晶體結(jié)構(gòu)中主要的鍵長(nm)如下:Cd(1)—N(4):2.409(7);Cd(1)—N(2):2.461(8);Cd(1)—N(1):2.429(8);Cd(1)—O(3):2.507(3);Cd(1)—N(3):2.489(10);Cd(1)—O(1):2.527(3).

配合物晶體結(jié)構(gòu)中主要的鍵角(°)如下:N(4)—Cd(1)—N(2):88.6(2);N(4)—Cd(1)—N(1):154.8(3);N(2)—Cd(1)—N(1):67.9(3);N(4)—Cd(1)—O(3):106.13(18);N(2)—Cd(1)—O(3):156.8(2);N(1)—Cd(1)—O(3):93.86(19);N(4)—Cd(1)—N(3):67.6(3);N(2)—Cd(1)—N(3):81.7(3);N(1)—Cd(1)—N(3):98.9(3);O(3)—Cd(1)—N(3):87.40(19);N(4)—Cd(1)—O(1):90.11(18);N(2)—Cd(1)—O(1):91.5(2);N(1)—Cd(1)—O(1):99.1(2);O(3)—Cd(1)—O(1):105.98(11);N(3)—Cd(1)—O(1):156.7(2).

其他晶體數(shù)據(jù):F(000)=1 750;R(int)=0.018 2;Z=25;-11≤h≤10，-16≤k≤18，-18≤l≤17;R1=0.109 9，wR2=0.390 5(I＞2σ(I);R1=0.1145，wR2=0.402 0(所有數(shù)據(jù)).

通過X-射線衍射數(shù)據(jù)分析其分子結(jié)構(gòu)可得該配合物的基本結(jié)構(gòu)，如圖1所示.由圖1可以看出，配合物以鎘離子為配位中心，展示了一個扭曲的八面體構(gòu)型.在分子結(jié)構(gòu)中，N1、N2、N4、O3處于扭曲八面體的赤道平面上，而N3和O1則分布在赤道平面兩端的軸向位置且不為一條直線，N3—Cd1—O1 角度為 156.708(223)°，有較大程度的扭曲.而赤道位置的4個配位原子Cd1、N1、N2、N4、O3 幾乎在同一平面上，O3—Cd1—N4為 106.102(184)°、N4—Cd1—N2 為 88.640(268)°、N2—Cd1—N1 為 67.887(276)°、N1—Cd1—O3 為93.869(190)°，和約為356.499°.在配合物Cd-1，10-菲啰啉中，以Cd1為中心離子的結(jié)構(gòu)之間由于1，10-菲啰啉芳香環(huán)之間存在π-π堆積弱作用，這種作用是由π鍵的負(fù)靜電勢與陽離子間發(fā)生的非共價相互作用，具有相當(dāng)?shù)膹姸?，它不等同于氫鍵，在生物體系中起很大的作用.芳環(huán)中心原子間距離為0.361 9 nm，均符合π-π堆積弱作用范圍，從而形成一維鏈狀結(jié)構(gòu)，其一維鏈狀結(jié)構(gòu)如圖2所示.

圖2 配合物的一維結(jié)構(gòu)Fig.2 One-dimensional net structure of the complex

一維分子鏈之間存在氫鍵和C—H…π鍵弱作用，鍵長分別為0.266 6 nm和0.281 5 nm.氫鍵和C—H…π鍵弱作用的存在從而把一維鏈狀結(jié)構(gòu)相互連接起來形成二維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)如圖3所示.由于分子間存在π-π堆積弱作用，氫鍵作用和C—H…π鍵弱作用，分子間堆積構(gòu)成了三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)如圖4所示.

圖3 配合物的二維氫鍵作用和π-π堆積弱作用Fig.3 The 2D network of the complex constructed through hydrogen bonds

圖4 配合物三維結(jié)構(gòu)Fig.4 Three-dimensional structure of complex

1.5 配合物與HC-DNA作用的熒光光譜測定

溴化乙錠(EtBr)是一種熒光染料，具有共軛芳香環(huán)的平面分子，這種共軛扁平分子可以平行地嵌入DNA雙鏈的配對堿基對之間，形成堆積.EtBr本身具有較弱的熒光，而DNA分子沒有熒光，當(dāng)EtBr插入DNA分子之后，EtBr分子好像平行地“固定”在DNA分子內(nèi)部，從而使EtBr分子平面剛性增加，碰撞淬滅減小，熒光顯著增強.EtBr只能插入雙螺旋DNA分子中，而不能插入單鏈DNA中.DNA/EtBr復(fù)合物中，EtBr發(fā)出的熒光比游離的EtBr本身發(fā)射的熒光強度大10倍［2］.當(dāng)EtBr從雙螺旋中游離出來或雙螺旋結(jié)構(gòu)減少時，熒光就會顯著降低.所以當(dāng)有其他也能嵌入DNA堿基之間的分子存在時，將會與Et-Br競爭DNA，EtBr將被從 DNA/EtBr復(fù)合物中擠出，而DNA/EtBr體系的熒光產(chǎn)生猝滅，因而EtBr可作為DNA結(jié)構(gòu)的熒光探針［3］.根據(jù)經(jīng)典斯特恩公式［4］:I0/I=1+Ksqr，其中:I，I0分別代表配合物/EtBr/DNA復(fù)合物中存在和不存在配合物時復(fù)合物的熒光強度，Ksq表示斯特恩淬滅常數(shù)，定性描述配合物與DNA的作用強弱，r為復(fù)合物中配合物與DNA的濃度比.

從圖5可看出配合物對DNA-EtBr體系熒光強度的影響，DNA-EtBr復(fù)合物的熒光發(fā)射峰處于617 nm處;隨配合物濃度的增加，DNA-Et-Br復(fù)合物體系的熒光強度均逐漸減弱，且發(fā)生不同程度的淬滅，并且濃度越大，熒光猝滅逐漸趨于平衡.當(dāng)配合物的濃度逐漸增加到最大時，配合物把DNA-EtBr復(fù)合物體系的熒光強度由96.42淬滅到78.94，下降幅度為17.48，這些現(xiàn)象說明配合物與DNA發(fā)生了插入作用.

圖5 配合物與DNA作用的熒光圖Fig.5 Fluorescence spectra binding to DNA of complex

從圖6可以看出配合物的淬滅常數(shù)Ksq=0.103，對HC-DNA具有一定的插入能力.

圖6 配合物的猝滅常數(shù)Fig.6 Stern-volmer quenching plot of the complex with the value of the slope

1.6 凝膠電泳法研究鎘配合物對pBR322-DNA的切割作用

在外電場作用下，帶電顆粒如不處于等電狀態(tài)的蛋白分子，將向著與其相反的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳.核酸DNA在一定的pH值下帶有負(fù)電荷，在電場中向正電極移動.電泳時，樣品在電槽中外電場的作用下發(fā)生移動，超螺旋帶(FormⅠ)相對分子質(zhì)量較小，在電場的作用下遷移速率較大，開環(huán)帶(FormⅡ)次之.實驗中，隨著配合物濃度增加，F(xiàn)ormⅠ解旋慢慢轉(zhuǎn)化為FormⅡ，同時DNA會發(fā)生一定降解［5-6］.以瓊脂糖為支持介質(zhì)的凝膠電泳是測定金屬配合物對DNA發(fā)生切割或嵌入、解旋作用的重要實驗方法，為DNA分子及其片段的相對分子質(zhì)量測定和DNA分子構(gòu)象的分析提供了重要手段，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域，是定量、分離、鑒定和純化DNA片段的主要方法［7］.

凝膠電泳經(jīng)常使用的核酸有pBR322質(zhì)粒DNA［8-9］，PUC18 質(zhì) 粒 DNA［10］，PUC19 質(zhì) 粒DNA［11］和 K562 細胞 DNA［12］，其中 pBR322 質(zhì)粒DNA是電泳過程中用得最普遍的核酸，它是細菌質(zhì)粒DNA，呈共價閉環(huán)狀超螺旋DNA狀態(tài)，長度為4 363 bp，相對分子質(zhì)量2.88×106.當(dāng)超螺旋型(ccc)DNA的一條鏈上出現(xiàn)一個缺口(nick)時，超螺旋結(jié)構(gòu)解開，形成開環(huán)型(oc)［13］.若2條鏈在同一位置均發(fā)生斷裂時，則變?yōu)榫€形分子(linear).另外，某些能插入DNA雙螺旋堿基對之間的試劑如EtBr、放線菌素D可以改變DNA的超螺旋狀態(tài)，使負(fù)超螺旋減少，以至完全松開形成 oc甚至形成正超螺旋［13-14］.

圖7是配合物對pBR322-DNA斷裂實驗結(jié)果.Lane 0是純的pBR322-DNA，Lane 1～3為配合物(濃度分別為:13.2，6.6，3.3 mol/L)與DNA在有氧條件下反應(yīng)2 h的電泳圖像.根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳原理FormⅠ與配合物作用發(fā)生解旋逐漸轉(zhuǎn)化為FormⅡ，從圖7可以看出，隨著化合物濃度的增加，F(xiàn)ormⅠ在逐漸減少.此現(xiàn)象表明這些配合物對細胞DNA具有切割能力，使DNA大分子發(fā)生降解.但配合物在不同濃度下FormⅠ解旋轉(zhuǎn)化為FormⅡ的量不一樣，根據(jù)活性越大，F(xiàn)ormⅠ解旋轉(zhuǎn)化為FormⅡ的量越多的凝膠電泳原理［15-16］，可以看出配合物的活性較大，這與熒光光譜測定結(jié)果一致.

圖7 配合物對pBR322-DNA的切割電泳圖Fig.7 Photoactivated cleavage of pBR322-DNA for complex

2 結(jié)論

(1)采用常溫法合成鎘(Ⅱ)與1，10-菲啰啉的配合物.其分子形式為［Cd(phen)2O2］，其中phen為1，10-菲啰啉.通過元素分析、紅外光譜兩種手段對配合物進行了表征，表明合成的配合物為預(yù)期目標(biāo)產(chǎn)物.

(2)用X-射線單晶衍射技術(shù)測定配合物單晶的晶體結(jié)構(gòu).在鎘(Ⅱ)配合物晶體結(jié)構(gòu)中，中心離子Cd(Ⅱ)采取六配位模式，與4個N原子(來自2個1，10-菲啰啉)和2個O原子配位，形成扭曲的八面體結(jié)構(gòu).相鄰的2個1，10-菲啰啉芳環(huán)之間存在π-π堆積作用，形成一維鏈狀結(jié)構(gòu)，同時在配合物中氧和相鄰的1，10-菲啰啉芳環(huán)之間還存在氫鍵作用與C—H…π鍵作用形成二維層狀結(jié)構(gòu)，在層與層之間的弱作用下配合物又形成了三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu).這不但使其結(jié)構(gòu)更加新穎，而且增添了更多性質(zhì)和功能.

(3)配合物與DNA作用的熒光光譜研究表明:DNA/EtBr復(fù)合物中加入配合物后，會發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象，而且濃度越大猝滅現(xiàn)象越明顯，這說明配合物能與溴化乙錠競爭插入DNA堿基對中.

(4)配合物電泳實驗表明:配合物對pBR322-DNA具有一定的切割能力，這與熒光光譜測定的結(jié)論一致.

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