超高效液相色譜-質(zhì)譜法測定豬肉中9種β-受體激動劑殘留量

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,湛江524001)

β-受體激動劑(β-agonists)，是一類人工合成的藥物，在藥學上稱為β-腎上腺素受體興奮劑[1]。主要用于防治人、獸的支氣管哮喘和支氣管痙攣等癥狀。根據(jù)苯環(huán)取代基及其結(jié)構(gòu)，β-受體激動劑可分為苯胺型(克倫特羅、西馬特羅)、苯酚型(沙丁胺醇)、間苯二酚型(特布他林、萊克多巴胺、非諾特羅)[2]。研究表明，在動物飼料中添加β-受體激動劑具有營養(yǎng)再分配作用，可以明顯提高動物瘦肉率，因而常被非法用于動物飼養(yǎng)中[3]。長期食用含有β-受體激動劑殘留的食品會對人體健康產(chǎn)生極大的危害，甚至危害生命。目前，我國對該類藥物在動物飼養(yǎng)及相關(guān)產(chǎn)品中的使用都有嚴格的規(guī)定，并已將β-受體激動劑類列為動物源性食品中的重點監(jiān)控藥物，農(nóng)業(yè)部和各省市農(nóng)業(yè)主管部門均有相關(guān)機構(gòu)對畜禽產(chǎn)品中β-受體激動劑進行監(jiān)測。

目前已報道的β-受體激動劑檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法[4-6]、高效液相色譜法[7，8]、氣質(zhì)聯(lián)用法[9-11]和液質(zhì)聯(lián)用法[12-14]等。各個方法均有其優(yōu)缺點，其中酶聯(lián)免疫法程序簡單，分析速度快，檢測成本低，但考慮到樣品復(fù)雜的基質(zhì)體系，易出現(xiàn)假陽性或假陰性，從而造成誤判或漏判，僅作為初篩方法被應(yīng)用；而液相色譜法雖然定量結(jié)果準確度高，但靈敏度相對較低，對復(fù)雜基質(zhì)條件中低含量待測物質(zhì)的定性存在一定困難；氣質(zhì)聯(lián)用法需要使用N,O-雙三甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFA)[11]等衍生試劑進行衍生化處理，步驟較為繁瑣；超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有分析時間短、確證能力強、靈敏度高、抗干擾能力強等優(yōu)點，已逐漸成為分析測試的重要手段之一，將其應(yīng)用于食品中β-受體激動劑的檢測具有重要的現(xiàn)實意義。

由于β-受體激動劑在畜禽產(chǎn)品中與葡萄糖醛酸、硫酸酯蛋白等成分相結(jié)合[12]，有機溶劑直接浸提法可以較好的提取游離態(tài)的β-受體激動劑，但不能將結(jié)合態(tài)目標物提取出來，也就不能準確反映樣品中待測物質(zhì)的實際含量，因此須將結(jié)合態(tài)的β-受體激動劑轉(zhuǎn)化為游離態(tài)再進行檢測。目前的研究主要集中在酸法水解[15]和酶法水解[16]，酸水解較為劇烈，且水解隨意性大，水解后產(chǎn)物眾多，可能增加測定時的基質(zhì)干擾。而酶水解過程相對溫和，由于酶具有專一性的特點，在合適的酶解條件下酶解樣品既能使結(jié)合態(tài)的β-受體激動劑轉(zhuǎn)化為游離態(tài)，又可以盡量避免產(chǎn)生過多的酶解產(chǎn)物干擾測定。目前我國相關(guān)質(zhì)檢機構(gòu)在畜禽產(chǎn)品中β-受體激動劑質(zhì)量安全專項中較多使用的是《農(nóng)業(yè)部1025號公告-18-2008》方法[16]，該方法需加酶酶解16h將結(jié)合的β-受體激動劑釋放出來，檢測過程耗費時間較長，對監(jiān)督和執(zhí)法等工作帶來了滯后性和不便性，因此需要進一步研究酶解的最佳作用條件，并建立超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，在準確定性、定量測定目標物的前提下縮短前處理和分析時間，以適應(yīng)快速檢測的發(fā)展趨勢。本實驗擬優(yōu)化提取豬肉中β-受體激動劑的酶解條件，建立豬肉中9種β-受體激動劑殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，為豬肉樣品中9種β-受體激動劑的快速確證和定量分析提供方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉購買于湛江市農(nóng)貿(mào)市場；特布他林、西馬特羅、沙丁胺醇、氯丙那林、非諾特羅、萊克多巴胺、克倫特羅、噴布特羅、妥布特羅，沙丁胺醇-D3、萊克多巴胺-D6及克倫特羅-D9(色譜純，德國Dr.Ehrenstorfer公司)；乙腈(色譜純，美國Spectrum公司)；乙酸銨(色譜純，美國DIMA公司)；甲酸(色譜純，Merck公司)； β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(100000 U/mL， Merck公司)；高氯酸、乙酸乙酯及異丙醇(分析純)；Oasis?MCX固相萃取柱(3 mL/60 mg，美國 Waters公司)；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQΜITY UPLCTM-TQD超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(配有電噴霧離子源(ESI)及Masslynx數(shù)據(jù)處理軟件，美國Waters公司)；T25高速均質(zhì)機、MS3 渦旋混合器(德國IKA公司)；Milli-QA10 超純水儀(美國Millipore公司)；CR22GⅢ 離心機(日本HITACHI公司)；E120H超聲波儀(德國Elma公司)；SWB-2000恒溫水浴搖床(天津奧特賽恩斯公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

單標儲備液：分別準確稱取特布他林、西馬特羅、沙丁胺醇、氯丙那林、非諾特羅、萊克多巴胺、克倫特羅、噴布特羅、妥布特羅標準品10 mg，用甲醇超聲溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成100 μg/mL的單標儲備溶液， -18℃避光保存。

混合標準中間液：分別準確吸取9種單標貯備液1.0 mL于100 mL容量瓶中，加甲醇定容，配制成1.0 μg/mL的混合標準中間液。

混合內(nèi)標工作液：分別吸取適量沙丁胺醇-D3、萊克多巴胺-D6、克倫特羅-D9標準溶液，用甲醇配成100 ng/mL的混合內(nèi)標液。

1.3.2 標準曲線溶液的配制

吸取混合標準中間液和混合內(nèi)標工作液適量，配制成9種β-受體激動劑質(zhì)量濃度分別為0.25、1、2、5、10 μg/L的系列標準工作溶液，其中3種內(nèi)標的質(zhì)量濃度均為1 ng/mL，依次進樣10 μL，并繪制標準工作曲線。

1.3.3 樣品預(yù)處理1.3.3.1 樣品前處理

將購買回的豬肉去脂肪，取瘦肉部分充分絞碎，備用。

1.3.3.2 樣品的酶解

稱取2 g絞碎樣品于50 mL塑料離心管中，加入8 mL 0.2 mol/L乙酸銨緩沖溶液(pH為5.2)，8000 r/min高速勻漿30 s，再加入適量β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，渦旋混勻，放置在37 ℃水浴搖床恒溫振蕩適當時間。

1.3.3.3 樣品的提取

酶解到達預(yù)定時間后取出，放置至室溫并充分渦旋，5000 r/min離心8 min，吸取上清液，加入內(nèi)標工作液及0.1 mol/L高氯酸溶液5 mL，充分渦旋混合，用高氯酸調(diào)節(jié)溶液pH值為1.0±0.2，以8000 r/min高速離心8 min去除沉淀，移取上清液并用10 mol/L和1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至11。加入10 mL飽和氯化鈉溶液，用10 mL異丙醇-乙酸乙酯(6:4)溶液提取兩次，渦旋混勻10 min，8000 r/min離心8 min后取有機相置于40 ℃水浴下氮氣吹干。吹干后的殘留物用5 mL 0.2 mol/L乙酸銨緩沖溶液(pH為5.2)，超聲溶解備用。

1.3.3.4 樣品的凈化

Oasis?MCX固相萃取柱先用2 mL甲醇、2 mL去離子水活化。取上述提取液全部過柱，再依次用2 mL去離子水、2mL 2%甲酸溶液淋洗，真空泵負壓下抽干，用5%氨水甲醇溶液2.5 mL洗脫，洗脫液在40 ℃水浴下氮氣吹干。殘渣用1.0 mL含0.1%甲酸的甲醇水溶液(5:95,v/v)溶解，超聲混勻后全部轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，15000 r/min高速離心8 min，取上清液經(jīng)0.2 μm濾膜過濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.4 色譜及質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(50×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：A(乙腈)-B(0.1%甲酸水溶液)；流速：0.3 mL/min ；柱溫：40 ℃；進樣量：1 μL。梯度洗脫：0 min～2 min，維持5%的A；2 min～10 min， 5%的A線性變化到60%A；10 min～12 min，60%的A線性變化到5%A；12 min～13 min，維持5%的A。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離源(ESI)；掃描方式：正離子模式；毛細管電壓：3.0 kV；離子源溫度：110 ℃；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流量：750 L/h；錐孔反吹氣流量：50 L/h；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

采用電噴霧電離源，分別將質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL的β-受體激動劑單標標準溶液注入質(zhì)譜儀進行全掃描，找出準確的[M+H]+峰，并以其為母離子進行轟擊獲得二次碎裂產(chǎn)生的碎片離子，分別找出2個信號較強的碎片離子與母離子組成監(jiān)測離子對，并分別對錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化。優(yōu)化獲得的多反應(yīng)監(jiān)測模式離子對及質(zhì)譜條件見表1。

2.2 色譜條件的選擇

采用超高效液相色譜儀和ACQUITY UPLC BEH C18柱對樣品進行分離，在流動相的選擇上比較了甲醇-水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-5mmol/L乙酸銨溶液對目標物質(zhì)的分離效果。結(jié)果表明3種流動相均可以分離9種β-受體激動劑，但使用乙腈-0.1%甲酸水溶液能更好分離待測組分，而且色譜柱的柱壓更低，各色譜峰的信噪比更高，峰形更好，因此選擇用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相。比較乙腈含量從2%～60%的出峰時間和分離效果，優(yōu)化了流動相梯度洗脫的程序，確定流動相初始濃度為乙腈-0.1%甲酸水溶液(5/95,v/v)，在此梯度洗脫條件下出峰時間合適，峰形好，9種β-受體激動劑的MRM色譜圖見圖1。

表1 β-受體激動劑測定的質(zhì)譜條件

注：*為定量離子

2.3 酶解條件的選擇

動物體在吸收β-受體激動劑，經(jīng)過代謝后大多數(shù)會與硫酸酯蛋白和葡萄糖醛酸作用，以硫酸軛合物和葡萄糖醛酸軛合物等結(jié)合態(tài)形式存在，因此需要將其轉(zhuǎn)化為游離態(tài)進行檢測。采用β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶對豬肉樣品進行酶解，以9種β-受體激動劑的總峰面積為指標，考察了在37℃，pH=5.2的條件下β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶的添加量和酶解時間對β-受體激動劑殘留測定結(jié)果的影響(圖2，圖3)。

從圖2和圖3可以看出，隨著酶添加量的增加和酶解時間的延長，9種β-受體激動劑的總峰面積呈現(xiàn)先增加后降低的規(guī)律，在分別對9種β-受體激動劑峰面積進行分析后發(fā)現(xiàn)這主要是由于非諾特羅和噴布特羅兩種成分峰面積降低所致。一方面，在酶解的前期隨著酶加量和酶解時間的延長，呈結(jié)合態(tài)的β-受體激動劑被釋放出來，各待測組分的測定值均增加。但另一方面，隨著酶解的深入，酶解的產(chǎn)物增多，基質(zhì)組分變得更加復(fù)雜，可能對非諾特羅和噴布特羅產(chǎn)生較大基質(zhì)抑制效應(yīng)，使得其測定值降低。因此，在37℃和pH=5.2的條件下，每克豬肉樣品中β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酶的適宜添加量為2500U，酶解時間為6.0h。

圖1 優(yōu)化條件下β-受體激動劑的MRM色譜圖(進樣體積為10μL，濃度為5μg/L)

圖2 酶添加量對9種β-受體激動劑總峰面積的影響(37℃，pH=5.2，酶解8.0h)

圖3 酶解時間對9種β-受體激動劑總峰面積的影響(37℃，pH=5.2，每克樣品酶加量為2500U)

2.4 方法的線性范圍和檢出限

在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下考察了9種β-受體激動劑的線性關(guān)系。以目標化合物質(zhì)量濃度與相應(yīng)內(nèi)標物質(zhì)量濃度的比值為橫坐標，目標化合物定量離子峰面積與相應(yīng)內(nèi)標物峰面積的比值為縱坐標，繪制待測物質(zhì)標準曲線(表2)。由表2可見，9種β-受體激動劑在0.25～10 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系。采用空白樣品基質(zhì)加標的方法，以S/N≥3時目標物的含量為該方法的檢出限，以S/N≥10時目標物的含量為該方法的定量限。經(jīng)計算本方法測定9種β-受體激動劑的檢出限為0.2 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg。

表2 9種β-受體激動劑的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.5 方法的回收率和精密度

在空白豬肉樣品中添加標準溶液進行添加回收率實驗，添加水平分別為0.5、1.0、5.0 μg/kg，每個添加水平進行6次重復(fù)實驗，加標回收率和精密度結(jié)果見表3。從表3可以看出，9種β-受體激動劑的回收率在80.4%～110.3%之間，相對標準偏差≤6.7%。

3 結(jié) 論

本研究優(yōu)化了提取豬肉中9種β-受體激動劑的酶解條件，并建立了同時測定豬肉中9種β-受體激動劑的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。在37℃和pH=5.2時，β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶的最佳酶解條件為每克豬肉中酶添加量為2500 U，酶解時間為6.0 h。9種β-受體激動劑以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相進行分析，樣品運行時間為13 min即可獲得滿意的分離效果。采用內(nèi)標法定量，在添加水平分別為0.5、1.0、5.0 μg/kg的條件下9種β-受體激動劑的回收率在80.4%～110.3%之間，相對標準偏差≤6.7%。該方法的樣品前處理時間和上機分析時間較短，且靈敏度高，回收率和重現(xiàn)性等均能滿足定量分析要求，結(jié)果準確可靠。適于豬肉中特布他林、西馬特羅、沙丁胺醇、氯丙那林、非諾特羅、萊克多巴胺、克倫特羅、噴布特羅、妥布特羅標的同時測定，尤其適合大批量樣品的快速確證和定量分析。

表3 空白樣品中β-受體激動劑的添加回收率及相對標準偏差(n=6)

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