RP-HPLC、UV及容量法測(cè)定甲硝唑的含量

張 娜，徐 強(qiáng)，周 娟

（1黃山學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，安徽 黃山 245041；2黃山食品藥品檢驗(yàn)研究所，安徽 黃山 245041）

甲硝唑，化學(xué)式為C6H9N3O3，是咪唑類抗阿米巴、抗滴蟲(chóng)、抗厭氧菌藥，因其具有抗菌力廣、殺菌力強(qiáng)、毒副作用小、無(wú)耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為治療厭氧菌感染的基本藥物之一［1］.其傳統(tǒng)的劑型主要有片劑和注射劑，臨床應(yīng)用主要用于治療牙周疾病、抗腹部術(shù)后感染、抗陰道滴蟲(chóng)等.

甲硝唑含量測(cè)定的方法有很多，如紫外分光光度法［2］，反相高效液相色譜法［3-4］，差分脈沖溶出伏安法［5］，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［6］，流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法［7］、反相流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法［8］，荷移增敏分光光度法［9］等.除以上幾種方法外，姜爽等人曾采用pH滴定法［10］進(jìn)行測(cè)定，但該方法有嚴(yán)格的濃度上的限制，不宜采用；朱梅芳采用的是雙波長(zhǎng)分光光度法［11］，此方法利用多種波長(zhǎng)測(cè)定，操作較為繁瑣，不便于快速測(cè)定.

《中國(guó)藥典》2000年版中對(duì)甲硝唑的含量測(cè)定使用容量法［12］.反相高效液相色譜法（RP-HPLC）分離效率高，靈敏度高，速度快，且配以數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，大大提高了其結(jié)果的準(zhǔn)確性，能夠?qū)⒓紫踹蛑械钠渌煞钟行Х蛛x，并測(cè)出單一組分甲硝唑的含量［13］.而紫外-可見(jiàn)分光光度法（UV）測(cè)定甲硝唑的操作條件要求不高，并且具有簡(jiǎn)便、快速及準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，因此也被廣泛地應(yīng)用［14］.為分析三種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，本文擬通過(guò)實(shí)驗(yàn)建立RP-HPLC、UV及容量法三種方法測(cè)定甲硝唑含量的方法對(duì)比.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及藥品

甲醇為市售色譜純，鹽酸、冰乙酸、醋酐、高氯酸、α-萘酚苯甲醇均為市售分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水；甲硝唑片劑為湖北華中藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；甲硝唑?qū)φ掌窞榉治黾?，中?guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn).

Sartorius BS110S電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；UV-2550紫外分光光度計(jì)（SHIMADZU公司）；Agilent 1200高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 容量法

參照2005版藥典二部的相關(guān)內(nèi)容.取甲硝唑20片，精密稱定，細(xì)磨.根據(jù)藥典上關(guān)于甲硝唑約0.13 g的量的規(guī)定，精密稱取適量細(xì)粉，然后緩慢加入冰乙酸10 mL，攪拌使之完全溶解.再滴加1%的萘酚苯甲醇指示液約2滴，用高氯酸滴定液（0.1 mol/L）滴定，直至溶液呈淺綠色為止.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的校正可利用空白試驗(yàn).用1 mL高氯酸滴定液相當(dāng)于消耗17.12 mg C6H9N3O3的量的比例來(lái)計(jì)算藥片所含有甲硝唑的量.

1.2.2 紫外分光光度法

參照2005版藥典二部的相關(guān)內(nèi)容.取本品10片，精密稱定，細(xì)磨.根據(jù)藥典上關(guān)于甲硝唑約50 mg的量的規(guī)定，精密稱取適量細(xì)粉.然后用漏斗將藥粉導(dǎo)入100 mL量瓶中，再加入HCl溶液（0.1 mol/L）80 mL，水浴微溫使之完全溶解.待其溫度恢復(fù)到室溫后，用HCl溶液（0.1 mol/L）稀釋至刻度.搖勻后濾過(guò)，濾液精密量取5 mL，置于200 mL量瓶中.再用HCl溶液（0.1 mol/L）稀釋量取的濾液至刻度，搖勻后測(cè)定其在277 nm的波長(zhǎng)處的吸光度值.結(jié)果根據(jù)藥典上關(guān)于甲硝唑藥片吸收系數(shù)的規(guī)定，按照吸收系數(shù)為377計(jì)算即可.

UV-2550的測(cè)量方式為吸收值；狹縫寬為0.2 nm；光源轉(zhuǎn)換波長(zhǎng)為350.0 nm；室溫為17℃；相對(duì)濕度為60%.波長(zhǎng)范圍（nm）為290.0到260.0；掃描速度為中速；采用間隔為0.2 s；自動(dòng)采樣間隔為停用；掃描模式為自動(dòng).

空白溶劑的適用條件按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，波長(zhǎng)在251 nm到300 nm處的吸光度值不得超過(guò)0.10.本實(shí)驗(yàn)測(cè)得空白溶劑在277 nm波長(zhǎng)處的吸光度值為0.049，符合標(biāo)準(zhǔn).

1.3 高效液相色譜法

溶液制備參照2005版藥典二部的相關(guān)內(nèi)容，對(duì)照品需要在105℃下干燥至少2 h以上才能使用.用分析天平稱取0.124 5 g甲硝唑?qū)φ掌?，置?0 mL容量瓶中，加適量50%甲醇（約30 mL）振搖使其溶解，當(dāng)其完全溶解后用流動(dòng)相定容至刻度，制成的溶液中含2.49 mg/mL的甲硝唑.供試品溶液是根據(jù)藥典上關(guān)于甲硝唑約100 mg的量的規(guī)定，精密稱取適量細(xì)粉，然后用漏斗輕輕導(dǎo)入到50 mL容量瓶中，加適量50%甲醇（約30 mL）振搖使其溶解后用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm的濾膜濾過(guò).

分別量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μL注入高效液相色譜儀中，并且記錄色譜圖和相關(guān)數(shù)據(jù).本實(shí)驗(yàn)方法采用的是外標(biāo)法，故以峰面積計(jì)算.

高效液相色譜儀器參數(shù)與適用性條件如下：色譜柱：Gemini C18 125×4.6 mm，5 μm，填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動(dòng)相：甲醇-水（20∶80），流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm，進(jìn)樣量：20 μL.

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

容量法：兩次樣品取樣量分別為0.171 9 g，0.172 1 g，消耗體積分別為7.45 mL，7.33 mL，空白消耗體積為0.05 mL.用1 mL高氯酸滴定液相當(dāng)于消耗17.12 mg C6H9N3O3的量的比例來(lái)計(jì)算藥片所含有甲硝唑的量，可得標(biāo)示含量分別為93.19%，91.57%，平均值為92.38%，相對(duì)偏差為1.75%.其中標(biāo)示含量按照下式計(jì)算，即：

式中，V樣品=V總-V空白，即扣除空白后樣品實(shí)際消耗的滴定液體積.

UV法：兩次取樣量分別為0.066 28 g，0.065 78 g，測(cè)得樣品在277 nm波長(zhǎng)處的吸收值分別為0.513、0.512.空白溶劑在277 nm波長(zhǎng)處的吸光度值為0.049.計(jì)算可得標(biāo)示含量分別為98.20%，98.74%，平均值為98.47%，相對(duì)偏差0.55%.其中標(biāo)示含量按照下式計(jì)算.

式中，A樣品=A總-A空白，即扣除空白后樣品的實(shí)際吸光度值；E為吸光度系數(shù)，甲硝唑的吸收系數(shù)為377.

RP-HPLC 法：對(duì)照品峰面積（n=5）分別為 7 579.6，7 601.7，7 590.6，7 589.3，7 583.8，平均峰面積 7 592.2，RSD值（應(yīng)不大于2.0%）為0.09%，響應(yīng)因子（f）為3 049.1.兩次取樣品分別為0.165 2 g，0.165 2 g，供試品峰面積（n=2）分別為：7 411.4，7 413.2.計(jì)算可得標(biāo)示含量分別為97.26%，97.28%，平均值為97.27%，相對(duì)偏差0.02%.其中標(biāo)示含量按下式計(jì)算.

式中，A為峰面積，f為響應(yīng)因子.

三種實(shí)驗(yàn)方法的結(jié)果比較見(jiàn)表1.

表1 RP-HPLC、UV及容量法測(cè)定甲硝唑的含量對(duì)照

2.2 結(jié)果分析與討論

參照《中華人民共和國(guó)藥典》二部2005版有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，所測(cè)甲硝唑的含量，應(yīng)為標(biāo)示量的93.0%到107.0%.從表1可以看出，本實(shí)驗(yàn)中容量法、UV法、HPLC法所測(cè)定的甲硝唑的平均標(biāo)示含量分別為92.38%、98.47%、97.27%.相對(duì)偏差分別為1.75%、0.55%、0.02%.其中，容量法所測(cè)定結(jié)果已超出標(biāo)示量范圍，且相對(duì)偏差明顯偏大.在容量法中，使用萘酚苯甲醇作為指示劑，該指示劑在堿性范圍為藍(lán)綠色，酸性范圍為黃至綠色，以溶液呈淺綠色為滴定終點(diǎn)，由于酸堿型體的顏色對(duì)比度不高，在實(shí)際操作過(guò)程中，對(duì)于滴定終點(diǎn)的判斷存在一定困難，容易造成較大誤差.但該法樣品處理過(guò)程無(wú)需過(guò)濾即可直接滴定，因此方便用作實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)分析，但不適合作為質(zhì)量控制的手段.

UV法和HPLC法測(cè)定甲硝唑片劑中甲硝唑的含量，均在藥典標(biāo)示量范圍內(nèi)，且相對(duì)偏差較小，準(zhǔn)確度高，精密度好.其中，UV法需要扣除試劑空白，而HPLC法由于具有分離系統(tǒng)色譜柱的存在，無(wú)需扣除試劑空白，專屬性更強(qiáng)，選擇性更高，干擾更小.綜合考慮儀器的普及率以及實(shí)驗(yàn)的成本，UV法適合成分較簡(jiǎn)單的原料藥的分析，而HPLC法更適合復(fù)雜樣品的分析.

3 結(jié)語(yǔ)

甲硝唑有多種分析方法，各有優(yōu)點(diǎn)與不足.章竹君采用的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法［7］、李宇等人采用的反相流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法［8］、李芳等人的荷移增敏分光光度法［9］、姜爽采用的pH滴定法［10］以及朱梅芳采用的雙波長(zhǎng)分光光度法［11］等方法測(cè)定甲硝唑片中甲硝唑的含量都實(shí)際可行.但較之高效液相色譜法和紫外分光光度法，均不夠簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確，操作也較為繁瑣.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：采用高效液相色譜法和紫外分光光度法測(cè)定甲硝唑的含量均方便、快速并且準(zhǔn)確.但較之紫外分光光度法而言，高效液相色譜法的專屬性更強(qiáng)，靈敏度更高，結(jié)果也更可靠和準(zhǔn)確，適合成分復(fù)雜制劑的質(zhì)量控制，所以高效液相色譜法更適用于甲硝唑藥品含量測(cè)定的精密檢測(cè).故建議采用HPLC法測(cè)定甲硝唑片的含量.

為了更好的提高檢驗(yàn)質(zhì)量，還應(yīng)該進(jìn)一步研究探索，特別是在提取、分離方法上，以期發(fā)現(xiàn)更加合理的檢測(cè)方法.

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