馬青蘭,王 楷,張 弛,曹秋芬,孟玉平
(1.太原理工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,太原 030024;2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心,太原 030031)
土地和水是地球上重要的自然資源,然而在過去的幾十年里卻被各種復(fù)雜的有毒化合物污染,其中就包含重金屬[1]。2005年,廣東北江韶關(guān)段鎘嚴(yán)重超標(biāo)事件,2006年的湘江湖南株洲段鎘污染事故,2009年的湖南省瀏陽市鎘污染事件,2012年廣西龍江河的鎘污染等,嚴(yán)重地威脅著人民的健康。重金屬鎘具有毒性,長期接觸會引起慢性中毒,影響人體腎功能。常規(guī)的重金屬處理方法受經(jīng)濟(jì)技術(shù)指標(biāo)的限制有著局限性。利用基因工程構(gòu)建高選擇性基因工程菌,可以提高棗金屬硫蛋白(ZjMT)[2]與金屬離子的親和能力,增強(qiáng)微生物接受金屬離子的能力,對棗金屬硫蛋白的去除過程進(jìn)行數(shù)學(xué)模擬不僅具有較高的研究價值,還能減少不必要的工作量,既節(jié)省實(shí)驗(yàn)時間,又節(jié)約原料。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)路延篤做過猴金屬硫蛋白對重金屬的吸附試驗(yàn)[3];廈門大學(xué)鄧旭等人運(yùn)用基因工程技術(shù)處理重金屬廢水[4-5];本研究項目成功提取了棗金屬硫蛋白,并把它導(dǎo)入大腸桿菌成功繁殖,用工程菌處理重金屬。該項目取得了國家專利,獲得了棗樹金屬硫蛋白基因的cDNA 序列,在國際基因庫 DDBJ/EMBL/GenBank中的注冊序號是AB513130。本模型將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了整理,對米-門方程進(jìn)行了改進(jìn),用MATLAB5.3擬合出數(shù)學(xué)模型,又通過實(shí)驗(yàn)對方程進(jìn)行了驗(yàn)證。該方法提高了實(shí)驗(yàn)效率,降低了成本。
試驗(yàn)中所用的菌株均由山西省農(nóng)科院生物研究所提供。宿主菌為E.coli BL21(DE3),導(dǎo)入載體pGEX-4T-2的對照菌pGEX-B和導(dǎo)入重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-ZjMT的基因工程菌pGEX-ZjMT-B。其中,基因工程菌pGEX-ZjMT-B是以從棗樹的cDNA文庫中獲得的基因SpotⅠ-MT為模板,用PCR方法擴(kuò)增出MT基因225bp特異片段,將其亞克隆入pBluesciptIⅡSK-T載體,用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ分別酶切重組pBluesciptⅡSKT質(zhì)粒和原核表達(dá)載體PET28a,然后將MT基因片段和表達(dá)載體PET28a通過T4DNA連接酶進(jìn)行定向連接,用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切和PCR方法雙重鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒。
1)直接機(jī)理?;蚬こ叹鷓GEX-ZjMT-B應(yīng)用紫外光譜、圓二色譜等方法研究確定其有許多孤對電子,可以和重金屬離子諸多空軌道形成穩(wěn)定的配合物和螯合物。
2)間接機(jī)理。金屬離子在細(xì)胞表面的吸附,即細(xì)胞外多聚物和胞壁上的官能團(tuán)與金屬離子結(jié)合的被動吸附。去除機(jī)理中吸附作用是在5min左右完成,螯合作用在整個去除過程起關(guān)鍵作用,發(fā)生在0~48h之間。前兩個小時生長進(jìn)入對數(shù)期,20~24 h之間,pGEX-ZjMT-B基本進(jìn)入穩(wěn)定期,往后進(jìn)入衰減期。
本實(shí)驗(yàn)采用的主要儀器有SHY-2A型水浴恒溫振蕩器,722E型可見分光光度計,LRH-250-Ⅱ培養(yǎng)箱,101型電熱鼓風(fēng)干燥箱,SW-CJ-1D無菌操作臺,高壓鍋等。
1)先準(zhǔn)備30個型號相同的培養(yǎng)皿,用稀硝酸浸泡12h后用去離子水清洗,在無菌室晾干;稱取NaCl 2.0g、蛋白胨2.0g、酵母提取物1g,放入200 mL蒸餾水中充分?jǐn)嚢枞芙?,密封好?21℃高壓鍋中滅菌,使用時加熱到40℃。把培養(yǎng)皿分三組,每組10個;把原菌液用去離子水依不同比例稀釋,稀釋后按稀釋順序給第一組培養(yǎng)皿分別加入1mL的菌液,再做兩個平行樣。把40℃的培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)皿,待凝固后倒置于4℃的培養(yǎng)箱,24h后取出,按網(wǎng)格法數(shù)出菌落數(shù),計算平均值求得ln nCF。以培養(yǎng)基為對照,分別測出不同時間下600nm的吸光度值(DO600)。
2)取500μL已活化培養(yǎng)的菌液加入到50mL LB新鮮培養(yǎng)基中,記錄移入菌體的時間,并測量初始的DO600值,37℃振蕩培養(yǎng)。每隔一定的時間測量DO600,當(dāng)DO600為-0.06左右時,加入 Cd2+,觀察不同濃度下,細(xì)菌生長曲線的變化。記錄取樣時間,每隔兩小時依次取樣測定DO600的值。
基于米-門方程,建立了基因工程菌pGEXZjMT-B增長率和Cd2+濃度的數(shù)學(xué)模型。為研究重金屬Cd2+對基因工程菌pGEX-ZjMT-B增長率的影響,首先要建立鎘離子濃度對菌生長情況影響的關(guān)系式。模型中所用的數(shù)據(jù)以最小二乘法求得。筆者認(rèn)為,去除重金屬是一個快速的反應(yīng)過程,可忽略菌的內(nèi)原代謝。對其結(jié)果研究發(fā)現(xiàn),這樣做既方便數(shù)學(xué)模型的建立,又符合實(shí)際工程運(yùn)用。
不同Cd2+含量溶液中基因工程菌pGEXZjMT-B的平均生長速率的變化值見表1所示。
表1 pGEX-ZjMT-B的平均生長速率
根據(jù)表1,擬合一次線性方程得:
DO600的平均變化值即基因工程菌pGEX-ZjMT-B的生長速率,用MATLAB5.3軟件的優(yōu)化工具中任意曲線擬合出DO600和lg nCF的函數(shù)方程為:
這個方程的建立可以方便地從DO600直接求出菌濃度的值,如圖1所示。
圖1 DO 600和菌濃度的關(guān)系
由式(2)式(3)可以得出,菌濃度lgnCF和 Cd2+濃度的關(guān)系式,聯(lián)合米-門方程最終得出我們想要的基因工程菌pGEX-ZjMT-B增長率和Cd2+濃度的數(shù)學(xué)模型如下:
比較方程結(jié)果和試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明,方程和試驗(yàn)結(jié)果基本一致。
表2 方程結(jié)果和試驗(yàn)結(jié)果
本模型的建立是在基因工程菌最佳生長條件下進(jìn)行的,并假定它對鎘的去除是一個快速的反應(yīng)過程。在菌被激活后不斷測定DO600值,直到DO600=-0.06,此時它的生長進(jìn)入對數(shù)期,細(xì)胞生長不受限制,而且
傳統(tǒng)上是把DO600直接看做菌濃度,而這種方法有太多不便和不合理。例如,在使用分光光度計時對照液的選取,有時用蒸餾水,有時用原液;本實(shí)驗(yàn)用的是原培養(yǎng)基,這就造成DO600測量值明顯不同,如圖2所示。圖中,菌種的質(zhì)量濃度分別為0,300,600,900,1200μg/L.從圖中可以看到一種變化趨勢,并能表示不同鎘離子濃度下DO600的變化。圖3是lgnCF隨時間變化的曲線。
圖2 不同濃度Cd2+對菌生長情況的影響
圖3 菌隨時間的變化
用DO600表示菌濃度簡單方便,能表示工程菌生長的基本趨勢。雖然用擬合的方程直接求菌濃度,方法很麻煩,而且每種菌的曲線有差異,但是它能直接得出菌濃度,計算中需要用菌濃度時就方便了,并且從方程中可以求得任意時間的菌濃度,不需要每次都測量,省時省力。雖然f(x)有增減區(qū)間,但是f(x)是恒大于零的。因此,基因工程菌pGEX-ZjMT-B的增長速率是減小的,這與圖(2)顯示相吻合。而圖3更清晰地展示了工程菌生長的曲線,經(jīng)過多次線性擬合發(fā)現(xiàn)六次方程吻合性更高,但為了計算方便可換成低次計算。
本文提出的方法改進(jìn)了傳統(tǒng)菌濃度的測定方式,繼承了米-門方程的優(yōu)點(diǎn)。又由于基因工程菌對鎘離子的去除是一個快速的過程,省去了內(nèi)原代謝過程。從定性定量方面都比較客觀地反應(yīng)了菌濃度真實(shí)的狀況。該模型層次清楚,意義明確。由于每種菌的生長曲線不同,方程只適用于工程菌pGEXZjMT-B。
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