淫羊藿苷調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞骨形成和破骨細(xì)胞骨吸收的機(jī)制

馬小妮，葛寶豐，陳克明，周 建，石文貴，謝艷芳，郭曉宇，呂 享，成 魁，高玉海

蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所，蘭州 730050

淫羊藿苷調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞骨形成和破骨細(xì)胞骨吸收的機(jī)制

馬小妮，葛寶豐，陳克明，周 建，石文貴，謝艷芳，郭曉宇，呂 享，成 魁，高玉海

蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所，蘭州 730050

目的探討淫羊藿苷(ICA)調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收的機(jī)制。方法原代培養(yǎng)大鼠顱骨成骨細(xì)胞，茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色，加入10-5mol/L ICA 12、24、36、48 h后，用real-time RT-PCR檢測骨源性分化的調(diào)節(jié)基因OSX、Runt相關(guān)基因2(Runx- 2)、堿性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型膠原(CollagenⅠ)、骨保護(hù)素(OPG)和核因子κB受體活化因子配體(RANKL)基因表達(dá)，Western blotting檢測OPG、RANKL和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)。加入10-5mol/L ICA作用10～90 min，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。結(jié)果與對照組相比，ICA能明顯促進(jìn)骨形成，表現(xiàn)為OSX、Runx- 2、ALP和CollagenⅠ基因表達(dá)量及CollagenⅠ蛋白表達(dá)量明顯增加(P均<0.01)，同時(shí)提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。ICA也能明顯抑制骨吸收，表現(xiàn)為提高OPG及OPG/RANKL基因和蛋白水平的表達(dá)量。結(jié)論ICA可能是通過促進(jìn)OSX、Runx- 2、ALP和CollagenⅠ基因表達(dá)，提高CollagenⅠ蛋白表達(dá)量及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度來促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成；并通過促進(jìn)OPG及OPG、RANKL基因和蛋白水平的表達(dá)量來抑制破骨細(xì)胞骨吸收。

成骨細(xì)胞；核因子κB受體活化因子配體；骨保護(hù)素；淫羊藿苷；流式細(xì)胞儀

ActaAcadMedSin，2013,35(4)：432-438

淫羊藿苷(icariin，ICA)為中草藥淫羊藿的主要有效成分，本課題組前期研究表明，ICA不但能促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨性分化和成骨細(xì)胞的分化成熟[1- 3]，而且能抑制破骨細(xì)胞的形成和骨吸收活性[4]，但其都是在誘導(dǎo)劑(地塞米松)和ICA同時(shí)存在時(shí)觀察到ICA對骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨性分化和成骨細(xì)胞的分化成熟的影響，為了闡明ICA自身具有促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨形成活性、抑制破骨細(xì)胞的骨吸收作用，本研究觀察了不加地塞米松時(shí)，ICA單獨(dú)作用對成骨細(xì)胞的骨形成活性及對破骨細(xì)胞的骨吸收活性的影響，以期為臨床治療骨質(zhì)疏松提供理論依據(jù)。

材料和方法

材料出生48 h以內(nèi)的SPF級SD大鼠[甘肅省中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號：SCXK(甘)2004- 0006- 152]。標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(FBS)由蘭州民海生物公司提供，胰蛋白酶、β-甘油磷酸鈉、磷酸化抗壞血酸(ASAP)、地塞米松購自美國Sigma公司，DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，ICA購自中國藥品生物制品檢定所(純度>98%)，RNAiso Reagent、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime ScriptTMreagent Kit)、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTMⅡ)均購自大連寶生物公司。BCA蛋白定量試劑盒購自武漢博士德公司，F(xiàn)luo- 3-AM購自蘭州凱基生物公司，兔多克隆抗體OPG購自美國Santa Cruz公司，兔多克隆抗體RANKL購自美國CST公司，兔多克隆抗體Collagen Ⅰ購自美國Abcam公司，小鼠多克隆抗體β-actin、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/山羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物公司，PVDF膜購自美國Pierce公司。蛋白垂直電泳裝置購自美國Bio-Rad公司，F(xiàn)ACScalibur 流式細(xì)胞儀購自美國Becton-Dickinson公司，倒置相差顯微鏡購自日本OLYMPUS公司，紫外分光光度計(jì)和臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購自德國Heraeus公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)及加藥處理出生48h內(nèi)的SPF級SD大鼠，75%乙醇浸泡無菌條件下取出頭蓋骨，置入盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，去除骨膜、血管及結(jié)締組織，PBS漂洗2次，加入0.25%胰酶于37 ℃消化10 min，棄掉消化液，再加入0.1%Ⅱ型膠原酶37 ℃消化3次，每次15 min，收集并合并消化液，200目細(xì)胞篩過濾，收集消化液用1000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基懸浮，吹打均勻后，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/ml。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3d換液1次。待細(xì)胞生長至85%左右時(shí)加入終濃度為1×10-5mol/L的ICA分別培養(yǎng)12、24、36、48 h。

成骨細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)染色將傳代后的成骨細(xì)胞接種在35 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞形成鈣化結(jié)節(jié)時(shí)對其進(jìn)行染色，具體方法如下：棄培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，加入4%多聚甲醛固定10 min；棄固定液，加入pH 8.9、0.1%的茜素紅染色液，37 ℃水浴1 h，流水沖洗，換固定液照相記錄結(jié)果。

real-timeRT-PCR檢測各基因表達(dá)棄掉加藥至12、24、36、48 h的成骨細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS漂洗2次，加入1 ml Trizol裂解細(xì)胞，收集裂解液；加入200 μl氯仿混勻后室溫放置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液；加入等體積異丙醇，混勻后室溫放置15 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清液；加入1 ml 75%乙醇洗滌沉淀，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入40 μl無RNA酶ddH2O重懸沉淀，-80 ℃保存?zhèn)溆?。? μl總RNA，加入98 μl無RNA酶ddH2O，紫外分光光度計(jì)測定260、280和320 nm處的光密度值(A)，計(jì)算A260 nm/A280 nm值及RNA濃度。其中2.1>A260 nm/A280 nm值>1.9、RNA濃度>0.4 g/L的樣品可用于下一步實(shí)驗(yàn)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA，按照TaKaRa Prime ScriptTMReagent Kit 說明書合成cDNA-20 ℃保存?zhèn)溆谩CR擴(kuò)增cDNA，按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說明書添加PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火31 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增目的基因，檢測骨源性分化的調(diào)節(jié)基因OSX、Runt相關(guān)基因2(runt-related transcription factor 2，Runx- 2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、I型膠原(Collagen I)、骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)和核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)基因表達(dá)，合成的引物序列見表1，RT-PCR數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt法。

Westernblotting檢測OPG、RANKL和CollagenⅠ等相關(guān)蛋白表達(dá)棄掉加藥至12、24、36、48 h的成骨細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS漂洗2次，加入300 μl細(xì)胞裂解液RIPA，冰上靜置15 min后收集裂解液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。將上述裂解產(chǎn)物反復(fù)凍融裂解3次，12 000 r/min離心30 min，按照BCA- 200蛋白定量試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量，取20 μg蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上用封閉液封閉后，分別加入1∶1000的兔抗OPG、RANKL與CollagenⅠ和1∶1000小鼠抗β-actin，室溫振蕩2 h，洗滌3次，分別加入1∶10 000與1∶5000辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h，TBST漂洗后ECL顯色，結(jié)果用圖像分析軟件Scion Image beta 4.0分析灰度值，比較各組細(xì)胞OPG、RANKL和CollagenⅠ相對表達(dá)水平。

流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞內(nèi)鈣離子取對數(shù)生長期的成骨細(xì)胞，PBS漂洗2遍，加入終濃度為15 μmol/L的Fluo- 3/AM染液，置CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，PBS漂洗2遍，1500 r/min離心5 min去掉多余的染料。向上述細(xì)胞中加入終濃度為1×10-5mol/L的ICA分別作用10～90 min，流式細(xì)胞儀測定各時(shí)間點(diǎn)樣本的熒光強(qiáng)度，重復(fù)3次。按照下列公式計(jì)算細(xì)胞溶質(zhì)中鈣離子的濃度：鈣離子濃度=Kd×(F-Fmin)/(Fmax-F)，式中Kd是Ca2+結(jié)合Fluo- 3/AM的解離常數(shù)，37 ℃下為204 nmol/L。F為各樣本熒光強(qiáng)度的測定值，F(xiàn)max和Fmin分別是最大熒光強(qiáng)度和最小熒光強(qiáng)度的測定值，其測定方法為：在不加藥的、負(fù)載好熒光染料的試管中加入終濃度60 g/L的TritonX- 100、5 mmol/L的CaCl2，超聲混勻，靜置10 min后用流式細(xì)胞儀測定平均熒光強(qiáng)度，即Fmax；在不加藥的、負(fù)載好熒光染料的試管中加入終濃度為25 mmol/L的EDTA，超聲混勻，靜置10 min后用流式細(xì)胞儀測定平均熒光強(qiáng)度，即Fmin[5]。

表 1 RT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences of RT-PCR

OSX：骨源性分化的調(diào)節(jié)基因；Runx- 2：Runt相關(guān)基因2；OPG：骨保護(hù)素；RANKL：核因子κB受體活化因子配體；ALP：堿性磷酸酶

OSX：osterix；Runx- 2：runt-related transcription factor 2；OPG：osteoprotegerin；RANKL：receptor activator of nuclear factor-κB ligand；ALP：alkaline phosphatase

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

成骨細(xì)胞形態(tài)觀察細(xì)胞培養(yǎng)72 h開始融合成單層，細(xì)胞形態(tài)清晰呈長梭形、三角及多角等形狀，培養(yǎng)至12d左右時(shí)形成鈣化結(jié)節(jié)(圖1)。

ICA對成骨基因OSX、Runx-2、CollagenI和ALP的影響ICA作用成骨細(xì)胞24 h能夠明顯地提高OSX、Runx- 2和ALP基因mRNA表達(dá)量，與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)，OSX、Runx- 2和ALP mRNA表達(dá)量分別是對照組的8.4、6.6和5.6倍；ICA作用成骨細(xì)胞12 h能夠明顯提高CollagenⅠ mRNA表達(dá)量，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，CollagenⅠ mRNA表達(dá)量是對照組的4.4倍(圖2)。

ICA對OPG和RANKL基因表達(dá)量及其比值的影響ICA作用12和24 h時(shí)，OPG表達(dá)量略有升高，但與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；ICA作用36 h時(shí)，OPG表達(dá)量顯著升高，為對照組的6.2倍(P<0.01)；ICA作用48 h時(shí)，OPG表達(dá)量下降。RANKL的表達(dá)量在ICA作用12、24 h時(shí)有所升高，但與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；作用36、48 h時(shí)下降，與對照組相比差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。OPG和RANKL的比值趨勢與OPG相同，即36 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.01)，48 h時(shí)下降至對照組水平(圖3)。

A.培養(yǎng)72h的成骨細(xì)胞形態(tài)；B.培養(yǎng)至12d形成的鈣化結(jié)節(jié)；C.茜素紅染色的鈣化結(jié)節(jié)

A.a image of osteoblasts cultured for 72 hours；B.a image of mineralized nodules formed after culture for 12 days；C.a image of alizarin red-stained mineralized nodules

圖1 不同時(shí)期成骨細(xì)胞形態(tài)觀察(×100)

Fig1 Morphologies of osteoblasts at different time points(×100)

Runx- 2：Runt相關(guān)基因2；OSX：骨源性分化的調(diào)節(jié)基因；ALP：堿性磷酸酶；ICA：淫羊藿苷；與對照組比較，aP<0.01

Runx- 2：runt-related transcription factor 2；OSX：osterix；ALP：alkaline phosphatase；ICA：icariin；aP<0.01 compared with control group

圖2 ICA對成骨基因OSX、Runx- 2、Collagen Ⅰ和ALP的影響

Fig2 Effects of ICA on the mRNA levels of Runx- 2，OSX，ALP and CollagenⅠ

OPG：骨保護(hù)素；RANKL：核因子κB受體活化因子配體；與對照組比較，aP<0.01

OPG：osteoprotegerin；RANKL：receptor activator of nuclear factor-κB ligand；aP<0.01 compared with control group

圖3 ICA對成骨細(xì)胞OPG、OPG/RANKL表達(dá)的影響

Fig3 Effects of ICA on the mRNA expression of OPG and OPG/RANKL

ICA對CollagenI、OPG、RANKL蛋白表達(dá)的影響ICA處理36 h時(shí)，OPG的表達(dá)明顯高于對照組(P<0.01)，12 h和48 h組與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；24 h時(shí)OPG蛋白表達(dá)量有所升高，但與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；RANKL的表達(dá)在12、24、36、48 h均與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。OPG和RANKL蛋白表達(dá)量的比值與圖3中基因的表達(dá)趨勢基本一致。ICA處理12 h時(shí)，CollagenⅠ蛋白表達(dá)量顯著升高，為對照組的6.2倍，24、36和48 h時(shí)下降至對照組水平(圖4、5)。

ICA對成骨細(xì)胞胞漿中鈣離子濃度的影響ICA作用10 min時(shí)，鈣離子有明顯升高；作用20 min時(shí)，瞬間極大提高了鈣離子濃度并達(dá)到最高值；作用30 min時(shí)，鈣離子濃度略有下降但仍高于作用10 min時(shí)；作用40～50 min時(shí)，鈣離子再次上升，并于50 min時(shí)達(dá)到最大值，但低于20 min時(shí)；作用60～90 min時(shí)，鈣離子的濃度趨于下降水平，80～90 min時(shí)下降至基線水平(圖6)。

圖4 Western blotting檢測ICA對成骨細(xì)胞OPG、RANKL、Collagen Ⅰ蛋白表達(dá)的影響

Fig4 Effects of ICA on the protein expression of OPG，RANKL，and Collagen I as measured by Western blotting

與對照組比較，aP<0.01

aP<0.01 compared with control group

圖5 Western blotting檢測ICA對成骨細(xì)胞OPG、RANKL、Collagen Ⅰ表達(dá)影響的統(tǒng)計(jì)分析

Fig5 Effects of ICA on the protein expression of OPG，RANKL and Collagen Ⅰ as measured by Western blotting using Image-Pro Plus 6.0 software

圖6 ICA對細(xì)胞溶質(zhì)中鈣離子的影響

Fig6 Effects of ICA on cytosolic calcium

討 論

ICA是淫羊藿的主要有效成分之一，本研究主要探討了在不加誘導(dǎo)劑(地塞米松)的條件下，ICA對成骨細(xì)胞成骨活性的影響及破骨細(xì)胞骨吸收活性的影響。結(jié)果顯示，ICA單獨(dú)作用24 h時(shí)，能明顯提高OSX、Runx- 2和ALP基因的表達(dá)量。OSX是一種對成骨細(xì)胞分化很重要的轉(zhuǎn)錄因子，前成骨細(xì)胞分化為成熟的有功能的成骨細(xì)胞需要OSX的存在[6-7]，Runx- 2在成骨細(xì)胞的分化、成熟中發(fā)揮重要作用，同時(shí)Runx- 2蛋白參與成骨形成的早期階段[8]。ALP是成骨細(xì)胞分化的早期指標(biāo)，在成骨細(xì)胞的骨形成過程中，其數(shù)量和功能直接影響骨形成能力。由此推測，ICA可能是通過提高上述基因的表達(dá)量，促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨形成活性。

本研究結(jié)果顯示，ICA單獨(dú)作用12 h時(shí)，能顯著提高CollagenⅠ基因和蛋白的表達(dá)量。已知成骨細(xì)胞骨形成的最初階段能分化合成并分泌大量的Collagen Ⅰ蛋白，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨形成活性。

本研究中，ICA單獨(dú)作用10～90 min，可提高成骨細(xì)胞胞漿鈣離子濃度，20 min時(shí)達(dá)到最高值，50 min時(shí)再次使胞內(nèi)鈣離子升高，但不及20 min時(shí)。鈣離子是普遍存在的細(xì)胞內(nèi)第二信使[9]，其變化可作為一種信號引起明確的生理效應(yīng)，例如鈣離子升高可激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶[10]。已有研究報(bào)道，內(nèi)皮型一氧化氮合酶參與了骨分化與形成[11]，由此推測胞內(nèi)鈣離子的升高可能也與ICA促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨形成活性有關(guān)。

目前認(rèn)為，破骨前體細(xì)胞分化發(fā)育為成熟破骨細(xì)胞的過程中受骨髓基質(zhì)細(xì)胞或成骨細(xì)胞分泌的RANKL與OPG調(diào)節(jié)。OPG主要通過與RANKL直接結(jié)合，競爭性抑制RANKL與RANK的結(jié)合，從而抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收活性[12-13]。OPG/RANKL的比值決定了破骨細(xì)胞的命運(yùn)，比值降低則骨吸收增強(qiáng)；比值升高，則骨吸收降低。本研究結(jié)果顯示，ICA單獨(dú)作用36 h能顯著提高OPG基因和蛋白的表達(dá)；ICA單獨(dú)作用12、24、36、48 h，RANKL的表達(dá)有所上升，但與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OPG/RANKL比值的變化趨勢與OPG相似，即36 h OPG/RANKL比值最高。上述結(jié)果提示，ICA可能主要是通過提高OPG及OPG/RANKL的比值，發(fā)揮抑制破骨細(xì)胞的骨吸收活性。

綜上，本研究結(jié)果顯示，ICA可能是通過促進(jìn)OSX、Runx- 2、ALP和Collagen Ⅰ 基因表達(dá)，提高Collagen Ⅰ 蛋白表達(dá)量及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度來促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成；并通過促進(jìn)OPG及OPG、RANKL基因和蛋白水平的表達(dá)量來抑制破骨細(xì)胞骨吸收。

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MechanismsofIcariininRegulatingBoneFormationofOsteoblastsandBoneResorptionofOsteoclasts

MA Xiao-ni，GE Bao-feng，CHEN Ke-ming，ZHOU Jian，SHI Wen-gui，XIE Yan-fang，GUO Xiao-yu，Lü Xiang，CHENG Kui，GAO Yu-hai

Institute of Orthopaedics，Lanzhou General Hospital，Lanzhou Command of PLA,Lanzhou 730050，China

CHEN Ke-ming Tel：0931- 8994327，E-mail：chenkm@lut.cn

ObjectiveTo investigate the molecular mechanisms of icariin(ICA)in regulating the bone formation of osteoblasts and the bone resorption of osteoclasts.MethodsPrimary osteoblast cell cultures were obtained from newborn rat calvarial.Calcified nodules were stained by alizarin red.The mRNA levels of osterix(OSX)，runt-related transcription factor 2(Runx- 2)，alkaline phosphatase(ALP)，CollagenⅠ，osteoprotegerin(OPG)，and receptor activator of nuclear factor-κB ligand(RANKL)were analyzed by quantitative real-time RT-PCR，the protein levels of OPG，RANKL，and CollagenⅠ were examined by Western blotting，and the intracellular Ca2+concentration of osteoblasts was measured on a flow cytometer using the Cellquest program.ResultsCompared with control group，ICA markedly promoted bone formation by significant up-regulating the gene expressions of OSX，Runx- 2，ALP，and CollagenⅠ，the protein expression of CollagenⅠ(allP<0.01)，and the Ca2+concentration.Furthermore，ICA remarkably inhibited bone resorption by significant up-regulating the mRNA and protein expressions of OPG as well as the OPG/RANKL ratio.ConclusionsICA could promote bone formation of osteoblasts through inducting the gene expressions of OSX，Runx- 2，ALP and CollagenⅠ，and the protein expressions of CollagenⅠ，and by increasing the Ca2+concentration.Moreover，ICA could inhibit bone resorption of osteoclasts through regulating OPG/RANKL signal pathway.

osteoblasts；receptor activator of nuclear factor-κB ligand；osteoprotegerin；icariin；flow cytometry

陳克明 電話：0931- 8994327，電子郵件：chenkm@lut.cn

R977；R96

A

1000- 503X(2013)04- 0432- 07

2012- 07- 03)

甘肅省科技重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(09ZNKDA025)Supported by the Major Science and Technology Project of Gansu Province(09ZNKDA025)

10.3881/j.issn.1000- 503X.2013.04.014