抗骨增生片對兔膝骨關節(jié)炎軟骨組織病理形態(tài)影響研究

汪福東，郭義娟，董立新，王志文

（1.河北省玉田縣醫(yī)院內六科，河北 玉田064199；2.河北聯(lián)合大學中醫(yī)學院，河北 唐山063000）

抗骨增生片為純中藥制劑，收載于《衛(wèi)生部藥品標準》中，用于治療骨關節(jié)炎有較好的療效。其中的組成藥物被證實有緩解關節(jié)炎關節(jié)疼痛、消除關節(jié)腫脹、恢復關節(jié)功能等作用。我們通過建立兔膝骨關節(jié)炎模型，觀察抗骨增生片對兔膝骨關節(jié)炎（KOA）軟骨組織病理形態(tài)的影響，以探討其治療膝骨關節(jié)炎的作用機理，總結如下。

1 實驗材料

藥物：抗骨增生片（國藥準字Z22023683，批號050905。通化華夏藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn)），成分為熟地、鹿銜草、骨碎補（燙）、淫羊藿、肉蓯蓉、雞血藤、萊菔子（炒）。

動物：日本大耳白兔30只，體質量（2.50±0.15）kg。于室溫分籠飼養(yǎng)，按頓供給標準飼料（由河北聯(lián)合大學醫(yī)學院實驗動物中心提供），自由飲水。

試劑及儀器：木瓜蛋白酶（活力200萬U，天津諾奧科技發(fā)展有限公司提供）。電子天平（上海友聲衡器有限公司生產(chǎn)），SHH.W21.600三用電熱恒溫水浴箱（北京市長安科學儀器廠生產(chǎn)），光學顯微鏡BX50型（日本OLYMPUS公司生產(chǎn)）。

2 實驗方法

動物分組：日本大耳白兔30只，適應性喂養(yǎng)1周后，分別按體質量由小到大編號，據(jù)隨機數(shù)字表分為A（正常組）、B（模型組）、C（抗骨增生片組），每組各10只。

模型建立：按日本鬼頭康彥等［1］的兔膝關節(jié)腔內注入木瓜蛋白酶造成骨關節(jié)炎病變模型方法，用電子天平稱取1.6g200萬U木瓜蛋白酶，量杯中倒入50mL生理鹽水，將1.6g木瓜蛋白酶加入，待其完全溶解后加入生理鹽水共成100mL，即配制成1.6%木瓜蛋白酶生理鹽水溶液。將兔用氯胺酮（10mg/kg體質量，肌內注射）麻醉后，右后腿膝關節(jié)周圍剪毛，然后用碘伏消毒皮膚，輕彎曲膝關節(jié)，經(jīng)髕腱兩側進針，將1.6%木瓜蛋白酶生理鹽水溶液0.5mL注入兔膝關節(jié)腔，每隔3天注射1次，共注射3次。B、C兩組均用此種方法造模。期間動物用標準飼料正常飼養(yǎng)。

給藥：于第3次造模結束后第2天開始給藥。C組每日1次，抗骨增生片按成人每日每公斤體質量用藥量的6倍作為兔每日每公斤體質量的等效劑量 ，將藥溶于10mL生理鹽水中灌胃，A、B兩組灌入等量生理鹽水，各組灌胃4周。期間常規(guī)飼養(yǎng)，正常飲水。

標本采集及處理：于給藥4周后即造模后第38天，各組分別處死實驗兔10只，打開同側（右后腿）膝關節(jié)腔，取下右膝關節(jié)面脛骨平臺，標本立即用新鮮配制的4%多聚甲醛/0.1MPBS，含有1/1000DEPC固定液固定。10%EDTA（用1/1000DEPC配制）脫鈣10天，石蠟包埋后切片，切片部位取脛骨平臺標本前外象限的1/2的交界處。每個標本制作兩張切片，進行蘇木素和伊紅染色光鏡觀察，做病理形態(tài)學分析（參照C.Colombo［3］的關節(jié)軟骨病理標準制定積分統(tǒng)計表）。見表1。

表1 關節(jié)軟骨病理評估參數(shù)標準

3 實驗結果

A組可見關節(jié)軟骨4層結構（由外向內分別為表層、移行層、輻射層、鈣化層）清晰可辨，軟骨細胞無減少，排列整齊，潮線結構完整。B組關節(jié)軟骨結構破壞，表面出現(xiàn)明顯裂紋及廣泛脆裂，表層缺損明顯，可見廣泛性潰瘍面、軟骨細胞缺失、軟骨下骨暴露，軟骨細胞成簇明顯。C組關節(jié)軟骨結構較完整，表面有小裂紋及輕度脆裂，表層缺損輕微，潰瘍面較局限，軟骨細胞缺失、軟骨下骨暴露不明顯，可見小的軟骨細胞成簇。C組與B組各項病理積分比較均有顯著性差異（P＜0.01）。結果見表2~4。

表2 軟骨表層病理積分比較 （分，±s）

表2 軟骨表層病理積分比較 （分，±s）

注：與B組比較，△P<0.01。

組別 動物數(shù) 表層缺損 糜爛或潰爛 表面脆裂A組 10 -- -- --B 組 10 3.6±0.52 3.4±0.69 3.3±0.94 C組 10 2.1±0.57△ 1.6±0.70△ 1.6±0.70△

表3 軟骨深層病理積分比較 （分，±s）

表3 軟骨深層病理積分比較 （分，±s）

注：與B組比較，△P<0.01。

組別 動物數(shù) 裂紋 軟骨下骨暴露A組 10 -- --B 組 10 3.8±0.42 3.5±0.53 C組 10 1.8±0.63△ 1.5±0.53△

表4 軟骨細胞病理積分比較 （分，±s）

表4 軟骨細胞病理積分比較 （分，±s）

注：與B組比較，△P＜0.01。

組別 動物數(shù) 裂紋 軟骨下骨暴露A組 10 -- --B 組 10 3.6±0.52 3.4±0.52 C組 10 1.6±0.52△ 1.6±0.52△

表層缺損、糜爛或潰爛、表面脆裂、裂紋、軟骨下骨暴露、細胞成簇、軟骨細胞缺失各項病理總積分，C組與B組比較有顯著性差異（P＜0.01）。A組為正常組，故表中不做積分比較。結果見表5。

表5 病理總積分比較 （分，±s）

表5 病理總積分比較 （分，±s）

注：與B組比較，△P＜0.01。

組別 動物數(shù) 病理總積分A組 10 --B組 10 24.6±3.47 C 組 10 11.8±3.05△

4 討 論

骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是常見于老年人的關節(jié)退行性疾病，其特征為關節(jié)軟骨的侵蝕，邊緣骨增生（如形成骨贅），軟骨下硬化，以及滑膜和關節(jié)腔生化和形態(tài)學改變。晚期的病理改變包括軟化、潰瘍以及關節(jié)軟骨的局部侵蝕，也可伴有滑膜炎癥［4］。膝關節(jié)是最常受累的關節(jié)，膝關節(jié)損傷早期表現(xiàn)為活動時出現(xiàn)的膝關節(jié)疼痛，繼而關節(jié)腫大。發(fā)生在膝關節(jié)的骨關節(jié)炎為膝關節(jié)骨性關節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA），從膝關節(jié)軟骨退行性改變開始逐漸累及軟骨下骨質、滑膜、關節(jié)囊等關節(jié)重要結構，以局限性、進行性關節(jié)軟骨破壞及關節(jié)邊緣的骨贅形成為其主要病理形態(tài)學的改變。其特征可以概括為關節(jié)軟骨完整性破壞，軟骨下骨板的病變，關節(jié)邊緣骨質增生，滑膜慢性炎癥［5］。我們在實驗中，可能是觀察的時間尚短，未見有關節(jié)邊緣的骨贅（骨質增生）形成。

骨關節(jié)炎屬中醫(yī)“痹證”范疇，抗骨增生片有補腎、活血、止痛之效，可使腎強而骨壯、活血而瘀除。組方藥簡而力專，恰合骨痹寒、瘀、虛病機。

實驗結果顯示，木瓜蛋白酶關節(jié)腔注射造模后軟骨表層、軟骨深層、軟骨細胞，均出現(xiàn)了病理性損壞，與前面提到的骨關節(jié)炎患者出現(xiàn)的病理特征相似。同時，我們在取材時發(fā)現(xiàn)造模處脛骨周圍軟組織有充血現(xiàn)象，關節(jié)囊肥厚，印證了“痹有瘀血”的論點，而抗骨增生片有活血化瘀之功，可使充血和肥厚減輕。病理觀察中發(fā)現(xiàn)，用抗骨增生片后軟骨細胞缺失積分明顯減少，損害得到改善。模型組軟骨表現(xiàn)為明顯的表面缺損、表面糜爛或潰爛、表面脆裂、形成裂紋、軟骨下骨暴露，完整的關節(jié)面消失。而用抗骨增生片后這些病理積分明顯減少。

抗骨增生片對兔實驗性膝骨關節(jié)炎軟骨損害具有修復作用。由此可以認為，抗骨增生片治療膝關節(jié)骨性關節(jié)炎可通過修復軟骨損害而發(fā)揮治療作用。

［1］Kitoh Y，Katsuvamaki T，Tanaka H，et al，Effect of SL-1010（Sodiumhyaluronate with moleculer weight）in experimental osteoarthritis induced by intro-articularly，applied papain in rabbits［J］.Folia pharmackl Japon，1992，100：67.

［2］孫敬方.動物實驗方法學［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：357.

［3］Colombo C，Butler M，O’Byrne E et al. A new model of osteoarthritis in rabbits I：Development of knee joint pathology following lateral meniscectomy and section of the fibular collateral and sesamoid ligaments［J］.Arthritis Rheum，1983，26（7）：875-885.

［4］左曉霞，陶立堅，高潔生主譯.凱利風濕病學［M］.7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：1276.

［5］侯德才，劉元祿，邰東旭，等.骨性關節(jié)炎的病因與機制研究進展［J］.中醫(yī)正骨，2006，7（18）：73.