大孔樹(shù)脂混用技術(shù)分離純化桑葉總酚

王 藝，彭國(guó)平*，歐陽(yáng)臻，李存玉，鄭云楓，李賀敏，李紅陽(yáng)

1南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 210023;2江蘇大學(xué)藥學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013

桑葉為桑科植物桑(Morus alba L.)的干燥葉。有疏散風(fēng)熱、清肺潤(rùn)燥、清肝明目之功效。主治風(fēng)熱感冒、肺熱燥咳、頭暈頭疼、目赤暈花等癥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，桑葉可抑制血糖升高，具有預(yù)防和治療糖尿病的作用，這與桑葉中含有的酚類(lèi)成分有關(guān)［1］，所以對(duì)桑葉中酚類(lèi)成分的研究成為目前桑葉研究的熱點(diǎn)之一。

目前，對(duì)酚類(lèi)成分的富集方法主要有大孔樹(shù)脂富集［2］，聚酰胺富集［3］。其中大孔樹(shù)脂以其成本低，操作方便等特點(diǎn)被廣泛用于總酚的吸附純化，王?。?］等利用大孔樹(shù)脂分離純化桑葉總黃酮，陳偉［5］等利用大孔樹(shù)脂聯(lián)用技術(shù)制備升麻總酚酸。但是大孔樹(shù)脂一次富集得到的總酚純度不高，二次上柱則又繁瑣耗時(shí)。本研究在對(duì)桑葉總酚進(jìn)行富集純化時(shí)對(duì)大孔樹(shù)脂型號(hào)進(jìn)行了篩選，研究樹(shù)脂混合使用的新工藝方法。對(duì)樹(shù)脂混合比例以及上樣量、濃度、流速和洗脫劑濃度進(jìn)行考察，并通過(guò)試驗(yàn)重復(fù)驗(yàn)證。本研究對(duì)主要成分富集提供了一種新穎的分離途徑，且方法簡(jiǎn)單易操作，為工業(yè)生產(chǎn)提供了一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Spectrum 752型紫外分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);Agilent 1100高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司);LIBROR AEL-40SM電子天平(十萬(wàn)分之一);KQ-100B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);PTHW型電熱套(鞏義市英峪予華儀器廠);TGL-16C高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

桑葉采自江蘇大學(xué)校園內(nèi)，晾干，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定為桑葉;咖啡酸對(duì)照品(批號(hào)110885-200102，中國(guó)藥品生物制品檢定所);大孔樹(shù)脂(HPD400、HPD826、HPD417、HPD722、HPD100、HPD600、D101、ADS-17，均購(gòu)于河北滄州寶恩化工有限公司);其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 大孔樹(shù)脂預(yù)處理

用95%乙醇浸泡過(guò)夜，濕法裝柱，水洗至無(wú)醇味，用2.5 BV(樹(shù)脂體積)的5%NaOH溶液洗脫至無(wú)色，后用水洗脫至中性;再用2.5 BV的5%HCl洗脫至無(wú)色，用水洗脫至中性，備用。

1.3 桑葉水提液的制備

取粉碎過(guò)篩的桑葉藥材適量，加14倍(生藥量)的水回流提取3次，每次1.5 h，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮，加水溶解至每1 mL含0.5 g生藥，過(guò)濾，備用。

1.4 桑葉總酚的制備

分別取經(jīng)過(guò)預(yù)處理的大孔樹(shù)脂 HPD400、HPD826、HPD417、HPD722、HPD100、HPD600、D101和ADS-17各200 mL，裝柱，取桑葉提取液(含生藥量120 g)，共8份，以濃度100 mg/mL，上樣流速為10 mL/min上樣，樹(shù)脂用 70%乙醇洗脫。另取HPD400和HPD826樹(shù)脂各100 mL，混合均勻，同法操作得洗脫液。

1.5 HPLC檢測(cè)條件

流動(dòng)相:乙腈(A)-0.5%乙酸水(B);洗脫梯度(0～5 min:30%A;5～10 min:30%→35%A;10～15 min:35%→40%A;15～18 min:40%→50%A;18～40 min:50%→80%A);檢測(cè)波長(zhǎng)358 nm;色譜柱:Hedera C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)。

1.6 MS條件

ESI離子源:源電壓為3.5 kV;正、負(fù)離子檢測(cè);鞘氣(N2)流速80 a.u.;輔助氣(N2)流速15 a.u.;碰撞氣體為He;毛細(xì)管溫度為250℃;毛細(xì)管電壓±5 V。采用全離子掃描方式，掃描范圍m/z 120～1000。

1.7 桑葉總酚含量測(cè)定方法

1.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱(chēng)取咖啡酸對(duì)照品適量，用60%乙醇溶解，制成1 mg/mL的溶液作為咖啡酸對(duì)照液。精密吸取對(duì)照液 0.5、1、2、4、8 mL 各兩份，分別置于 10 mL容量瓶中，一份分別加30%乙醇定容至10 mL作空白溶液;一份精密加入5%Na2SO3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再精密吸取10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，然后加入1 mol/L NaOH 4 mL，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，放置10 min，做供試品溶液。利用分光光度法，分別取空白溶液和供試品溶液在510 nm波長(zhǎng)出測(cè)定吸光度。以吸光度之差為縱坐標(biāo)y，以咖啡酸濃度為橫坐標(biāo)x，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 y=0．4233 x+0.0028，R2=0.9991，對(duì)照在0.05 ～ 0.8 mg/mL 線性良好。

1.7.2 樣品含量測(cè)定

精密量取樣品，兩份，適當(dāng)稀釋后，按照1.6.1項(xiàng)下，從“分別置于10 mL”，到“在510 nm波長(zhǎng)出測(cè)定吸光度”，然后帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得桑葉中總酚的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹(shù)脂型號(hào)的優(yōu)選

指紋圖譜是中藥質(zhì)量控制的有效手段，本研究采用HPLC檢測(cè)各種大孔樹(shù)脂對(duì)桑葉提取物的富集信息，比較各有效部位的指紋圖譜信息，并通過(guò)LC/MS技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證識(shí)別相關(guān)標(biāo)志性色譜峰，優(yōu)選出富集能力較好的大孔樹(shù)脂。

本研究對(duì) HPD400、HPD417、HPD100、HPD600、HPD722、HPD826、D101和 ADS-17八種大孔樹(shù)脂進(jìn)行比較分析。如圖1所示，HPD400和HPD826的富集成分的指紋圖譜的色譜峰的強(qiáng)度和數(shù)量均優(yōu)于其他6種大孔樹(shù)脂。HPD826對(duì)峰1、2和3的對(duì)應(yīng)物質(zhì)的吸附能力明顯優(yōu)于HPD400;HPD400對(duì)峰5和6所對(duì)應(yīng)物質(zhì)的吸附能力則較優(yōu)。將HPD400和HPD826以1∶1(v/v)進(jìn)行混合，該混合樹(shù)脂對(duì)峰1、2、3、5和6所對(duì)應(yīng)物質(zhì)的吸附能力均較優(yōu)。

本研究采用LC/MS技術(shù)和UV分析法，分別對(duì)大孔樹(shù)脂富集得到成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒別和含量測(cè)定，以佐證混合樹(shù)脂對(duì)桑葉提取物中總酚類(lèi)物質(zhì)的較優(yōu)的富集能力。LC/MS分析結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，圖1中峰1 ～5，6，9和10對(duì)應(yīng)峰物質(zhì)分別為新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、槲皮素-3，7-二氧葡萄糖苷、咖啡酸、5-O-咖啡酰莽草酸、蘆丁和槲皮素。

經(jīng)UV分析法分析，對(duì)八種大孔樹(shù)脂和混合樹(shù)脂所獲得的總酚的質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)分。綜合評(píng)分=總酚轉(zhuǎn)移率×0.5+總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)×0.5?？偡愚D(zhuǎn)移率和總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)是按以下方法計(jì)算得出:取“1.4”項(xiàng)下各種單一樹(shù)脂包括混合樹(shù)脂所得的乙醇洗脫液，根據(jù)“1.6.1”項(xiàng)下總酚含量測(cè)定方法測(cè)得每個(gè)樹(shù)脂洗脫的總酚質(zhì)量，并求出總酚從提取液中到乙醇洗脫液的轉(zhuǎn)移率;同時(shí)精密量取部分洗脫液，干燥，稱(chēng)重，算出總酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。如表2所示，HPD400和HPD826各自吸附的總酚轉(zhuǎn)移率和綜合評(píng)分均優(yōu)于其他樹(shù)脂，這和液相檢測(cè)圖譜數(shù)據(jù)一致。兩者混合后的混合樹(shù)脂圖譜綜合評(píng)分也變高，進(jìn)一步的驗(yàn)證了上述液相的分析結(jié)果。

綜上分析，本研究選取HPD400和HPD826兩種大孔樹(shù)脂進(jìn)行混合使用，以期較好的富集桑葉提取物中的總酚類(lèi)成分。

表 1 HPLC-ESI-MS 分析結(jié)果［6-10］Table 1 Results of HPLC-ESI-MS analysis

圖1 不同樹(shù)脂吸附總酚的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of total phenols extracted from different resins

2.2 HPD826和HPD400混合比例的篩選

進(jìn)一步對(duì)優(yōu)選出的HPD826和HPD400兩種樹(shù)脂的混合比例進(jìn)行研究，以獲得較優(yōu)的富集效果。取 HPD826 和 HPD400 適量，按照 0.5∶1;1∶1;2∶1;3∶1的不同體積比混合成200 mL，分別裝柱，按照“1.4”項(xiàng)下裝柱，同法操作，得乙醇洗脫液，以上述的綜合評(píng)分為指標(biāo)。如表3所示，兩者體積比例為1∶1時(shí)明顯優(yōu)于其它所考察比例，效果最好。故最終確定HPD826和HPD400的混合體積比為1∶1。

表2 不同樹(shù)脂洗脫的總酚含量比較Table 2 Comparison of contents of total phenols from different resins

2.3 總酚純化工藝的優(yōu)選

總酚的純化工藝除了要求選擇較好的富集材料，對(duì)于純化過(guò)程的試驗(yàn)參數(shù)，如上樣量、上樣濃度、上樣速度、洗脫劑的濃度等，也需進(jìn)行考察。

表3 HPD400和HPD826混合比例的篩選Table 3 Determination of the ratio of HPD400 and HPD826

圖2 泄漏曲線Fig.2 Leakage curve

2.3.1 泄漏曲線

取經(jīng)過(guò)預(yù)處理的混合大孔樹(shù)脂200 mL，藥液濃度為以桑葉藥材生藥量計(jì)為100 mg/mL，上樣流速為6 mL/min，每200 mL(即生藥量20 g)為一流份，按照“1.6.2”項(xiàng)下方法檢測(cè)總酚含量，結(jié)果見(jiàn)圖2。當(dāng)生藥量超過(guò)180 g時(shí)，總酚濃度陡然上升，出現(xiàn)明顯泄漏，因此為在保證總酚的同時(shí)又能增大上樣量，初步選擇160 g生藥量作為上樣量。

2.3.2 桑葉總酚富集工藝的因素考察

2.3.2.1 正交實(shí)驗(yàn)

取經(jīng)過(guò)預(yù)處理的大孔樹(shù)脂200 mL，9份。選取上樣量(生藥量)、上樣濃度、上樣流速和乙醇濃度四個(gè)因素作為考察因素，設(shè)計(jì)正交因素水平表，見(jiàn)表4。以綜合評(píng)分作為考察指標(biāo)，選用L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，方差分析見(jiàn)表6，從直觀分析可看出:四個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響大小次序?yàn)锳＞C＞D＞B;從方差分析結(jié)果可見(jiàn)上樣量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響，上樣濃度影響最小，從節(jié)省時(shí)間考慮選擇濃度最大的水平3，綜合選擇最佳工藝為A2B3C1D2，即上樣量160 g，上樣濃度150 mg/mL，上樣流速10 min/mL，60%乙醇洗脫。2.3.2.2 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

表4 因素水平表Table 4 Factors and levels of orthogonal design

表5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Design and results of Orthogonal Design test

均值1 62.600 62.100 64.033 62.033均值2 64.967 62.733 62.500 63.633均值3 60.100 62.833 61.133 62.000極差4.867 0.733 2.900 1.633

表6 方差分析Table 6 Analysis of variance

按上述最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)三次，結(jié)果三次實(shí)驗(yàn)總酚轉(zhuǎn)移率的±s為(73.6±1.1)%;質(zhì)量分?jǐn)?shù)±s為(64.1±1.2)%;綜合評(píng)分±s為(69.0±0.9)%，結(jié)果證明工藝穩(wěn)定性良好。

3 討論

目前運(yùn)用大孔樹(shù)脂分離純化總酚比較普遍，但多采用單一樹(shù)脂或者樹(shù)脂聯(lián)用等純化方式。單一樹(shù)脂吸附會(huì)損失一定的成分，也有著總酚純度不高的缺點(diǎn);樹(shù)脂聯(lián)用技術(shù)工藝相對(duì)繁瑣。本文通過(guò)篩選樹(shù)脂發(fā)現(xiàn)兩種型號(hào)大孔樹(shù)脂混合起來(lái)使用有著很好的效果，從液相圖上看能使各個(gè)時(shí)間段的峰都能很好的加以保留，而且總酚得率及純度也都有所提高。在保證質(zhì)量的同時(shí)，提高了效率，但是目前僅對(duì)桑葉總酚進(jìn)行了富集工藝分析，本實(shí)驗(yàn)室下一步會(huì)逐步采用樹(shù)脂混用技術(shù)，研究中藥其它成分的富集的工藝，明確成分的分離原理，闡明成分的富集分離過(guò)程。

本文通過(guò)對(duì)桑葉總酚富集工藝進(jìn)行研究，確定了HPD400和HPD826兩種樹(shù)脂作為桑葉總酚的純化樹(shù)脂，兩種樹(shù)脂的最佳混合比例為1∶1(v/v)。兩種樹(shù)脂雖然極性相近，但都有各自的特征性吸附，HPD826的吸附原理是氫鍵吸附，能較好的保留一些多酚類(lèi)及有機(jī)酸類(lèi)成分如桑葉中的綠原酸等;HPD400是中極性的，能較好的吸附一些極性適中的成分如桑葉中的咖啡酸莽草酸和黃酮類(lèi)成分。兩者混合使用可以把兩者的吸附特點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，形成互補(bǔ)，達(dá)到對(duì)桑葉中有效成分的最大保留。

在樹(shù)脂篩選中，應(yīng)該以有效成分的富集為目標(biāo)，篩選適宜的樹(shù)脂以及混合比例或者聯(lián)用方式，提升大孔樹(shù)脂技術(shù)在中藥成分分離的中的適用性。

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