復(fù)方白花蛇舌草和半枝蓮總黃酮提取工藝的研究

胡 榮，李召輝，楊榮平，秦偉瀚，張小梅，王云紅，勵(lì) 娜，羅先欽*

1重慶市中藥研究院，重慶 400065;2重慶市第五人民醫(yī)院，重慶 400062

白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草［Oldenlandia diffusa(Willd.)Roxb.］的全草［1］，臨床上廣泛用于各種腫瘤的治療，尤多用于治療食道癌、胃癌、肝癌、直腸癌等消化系統(tǒng)腫瘤以及子宮頸癌、淋巴癌、鼻咽癌等［2］。半枝蓮為唇形科黃芩屬植物半枝蓮(Scutellaria barbata D.Don)的全草，臨床多用于治療肝癌、肺癌、胃癌、直腸癌和鼻咽癌［3］。現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究，黃酮類化合物對體內(nèi)、體外均有明顯的腫瘤抑制作用，并能清除自由基［4］。半枝蓮和白花蛇舌草配伍，將有似中藥七情配伍中的相須之用，可增強(qiáng)抑癌、排毒作用［5］。本研究以半枝蓮/白花蛇舌草質(zhì)量比為1∶1為原料，對其總黃酮等活性成分提取條件進(jìn)行研究，為進(jìn)行創(chuàng)新藥物的研究和開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

白花蛇舌草，購自重慶中藥材飲片廠有限公司，經(jīng)重慶市中藥研究院鐘國躍教授鑒定為茜草科植物白花蛇舌草(Oldnlandia diffusa Willd.)的干燥全草，產(chǎn)地江西，批號100401;半枝蓮，購自太極集團(tuán)四川綿陽制藥有限公司，經(jīng)重慶市中藥研究院鐘國躍教授鑒定為唇形科黃芩屬植物半枝蓮(Scutellaria barbata D.Don)的全草，產(chǎn)地湖北，批號55100005;蘆丁對照品，中國藥品生物制品檢定所，批號:100080-200306;其余試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

UV-1601型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津);AEG-45SM電子天平(日本島津公司);98-1-B型電子調(diào)溫電熱套(天津泰斯特儀器有限公司);DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

2 方法和結(jié)果

2.1 白花蛇舌草和半枝蓮總黃酮的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備

取蘆丁對照品4.5 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為180 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.2 最大吸收波長

取對照品溶液，稀釋至一定濃度，以甲醇為空白，于紫外分光光度儀上，在400～900 nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明對照品溶液在510±1 nm處有最大吸收，所以選定510 nm作為總黃酮測定波長。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對照品溶液 1、2、3、4、5 與 6 mL，分別置25 mL的量瓶中，各加水至6.0 mL，加5%亞硝酸溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外分光光度法，在510 nm波長處測定吸光度，以吸收度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算得回歸方程Y=0.0115X，r=0.9998。試驗(yàn)結(jié)果表明蘆丁在7.2～43.2 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.4 樣品含量測定

白花蛇舌草和半枝蓮總黃酮提取液精密量取1 mL置于25 mL量瓶中，按2.3項(xiàng)下自“各加水至6.0 mL”起，依法測定吸光度值，計(jì)算總黃酮提取液中多糖含量。

總黃酮含量(%)=樣品溶液中總黃酮含量×樣品溶液稀釋倍數(shù)/生藥重量

2.2 總黃酮提取工藝

2.2.1 總黃酮提取方法

取白花蛇舌草和半枝蓮質(zhì)量比為1∶1的原料若干，用乙醇提取若干小時(shí)，合并多次提取所得的濾液，即得總黃酮提取液。

2.2.2 總黃酮提取正交試驗(yàn)

取原料9份，稱重，每份10 g，采用正交試驗(yàn)法考察影響白花蛇舌草和半枝蓮總黃酮提取效率的因素，選擇乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取時(shí)間(C)和提取次數(shù)(D)作為影響因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，如表1所示，以總黃酮含量作為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)選，結(jié)果如表2。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

表2 L9(34)正交試驗(yàn)安排結(jié)果Table 2 Results of orthogonal tests

9 3 3 2 1 16.5 K1 20.800 18.767 18.867 15.700 K2 21.267 21.133 21.433 21.267 K3 19.267 21.433 21.033 24.367 R 2.000 2.666 2.566 8.667

試驗(yàn)結(jié)果表明，影響白花蛇舌草和半枝蓮總黃酮提取的各因素中，D＞B＞C＞A，其中因素D和B因素對多糖的提取影響較大，最佳提取工藝為A2B3C2D3，即用藥材30倍量的70%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，并進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

2.2.3 正交試驗(yàn)驗(yàn)證

稱取白花蛇舌草和半枝蓮藥材共10 g，共3份，根據(jù)篩選確定的最優(yōu)提取方案A2B3C2D3，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of verification tests

試驗(yàn)結(jié)果表明，白花蛇舌草和半枝蓮多糖的含量穩(wěn)定在27 mg/g左右，提示本正交試驗(yàn)優(yōu)選的工藝條件理想、可靠。

3 討論

本研究參考《中國藥典》2010版一部中測定槐花［6］總黃酮的方法，采用紫外分光光度法以蘆丁為對照品，測定白花蛇舌草和半枝蓮醇提取物中總黃酮的含量，經(jīng)試驗(yàn)表明該方法是一種簡便可行的測定該復(fù)方總黃酮的方法。

乙醇是一種極性適中、滲透性強(qiáng)和毒性小的有機(jī)溶劑。黃酮類化合物又屬于中級性化合物。因此本研究選用乙醇作為提取溶劑，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)選白花蛇舌草和半枝蓮總黃酮的最佳提取工藝。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(國家藥典委員會(huì)).Pharmacopoeia of the People's Republic of China(中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.appendix 23.

2 Zhong LM(鐘立敏)，Zhong HX(周宏霞)，Liu D(劉丹).Pharmacology and clinical application progress of Hedyotis diffusa.Info Tradit Chin Med(中醫(yī)藥信息)，2001，18(4):14-16.

3 Xu FM(許風(fēng)鳴)，Wang ZQ(王兆全)，Li YW(李有文).Studies on the chemical constituents of Scutellaria barbat II.Chin J Mod Applied Pharm(中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué))，1997，14(6):8.

4 Li S(李省)，Yang BH(楊保華)，Chen Y(陳悅)，et al.The content analysis of total flavonoids in Scutellaria barbat.Chin J Public Health(中國公共衛(wèi)生)，2005，21:847-848.

5 Hu R(胡榮)，Luo XQ(羅先欽)，Yang RP(楊榮平).Study on the preparation technology of polysaccharides in Oldenlandia diffusa Willd.and Scutellaria barbata D.Don.Chongqing Yixue(重慶醫(yī)學(xué))，2011，40:45-47.

6 Chinese Pharmacopoeia Commission(國家藥典委員會(huì)).Pharmacopoeia of the People's Republic of China(中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol I，333-334.