響應(yīng)曲面法優(yōu)化蟲草素和蟲草多糖的綜合提取工藝

鄧 黎，王曉虹，韓 濤，皮 立，韓 發(fā)

中國科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧 810008

現(xiàn)代科學(xué)論證冬蟲夏草和蛹蟲草不僅具有特殊的營養(yǎng)價(jià)值，而且有明顯的藥用價(jià)值。其中尤以蟲草素、蟲草多糖、蟲草酸等多種生物活性物質(zhì)的藥用價(jià)值最為顯著［1-4］。因此，冬蟲夏草和蛹蟲草受到了廣泛關(guān)注，已有大量藥品、保健食品上市，但這些產(chǎn)品多數(shù)停留在粗加工水平，缺乏市場競爭力，因此，要保證蟲草產(chǎn)業(yè)能夠持續(xù)穩(wěn)定的發(fā)展，就必須要提高其加工產(chǎn)品的科技含量。因此，研究冬蟲夏草和蛹蟲草中主要生物活性物質(zhì)的綜合提取工藝和提高其提取率具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣闊的市場應(yīng)用潛力［5，6］。

近年來，已有研究人員對蟲草素和蟲草多糖的綜合提取進(jìn)行了工藝改進(jìn)和優(yōu)化，但是所得到的優(yōu)化工藝均是在單因素或正交試驗(yàn)條件下獲得的［7，8］。響應(yīng)面分析法(response surface methodology，RSM)是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法，可檢查一個(gè)或多個(gè)響應(yīng)變量與一系列試驗(yàn)變量之間的關(guān)系，確定試驗(yàn)因素及其交互作用在工藝過程中對指標(biāo)響應(yīng)值的影響，并精確地表述因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系［9］。因此，本研究中將響應(yīng)面分析的方法應(yīng)用于蟲草中蟲草素和蟲草多糖的綜合提取工藝研究中，建立得率與考察因素之間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，為工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參數(shù)和理論依據(jù)。

在比較水熱回流法和超聲波水提法對綜合提取蟲草素和蟲草多糖的影響基礎(chǔ)上，采用超聲波提取法進(jìn)行初提，經(jīng)醇沉、Sevage法除蛋白、乙醇分級沉淀后獲得蟲草多糖［3］，醇沉后獲得的上清液用大孔樹脂和反相硅膠分離純化，制備型液相色譜分離制備獲得蟲草素［10］。最終利用響應(yīng)曲面法考察超聲提取時(shí)間、溫度和液固比對蟲草素和蟲草多糖綜合提取率的影響，得到最優(yōu)提取工藝并予以驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀，色譜柱Agilent Eslipse-XDB C18(5 μm，250 mm × 4.6 mm)，美國安捷倫公司;N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司);KQ 5200 DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);METTLER TOLEDO PL 203和 XS 204電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);P70D17TL-D 5微波爐(格蘭仕微波爐電器有限公司);制備型高效液相色譜儀(LC-8A，日本);DHG-9070 A型電熱恒溫故風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

野生冬蟲夏草購于青海玉樹，人工培養(yǎng)蛹蟲草CSM-8菌株由西寧世峰生物科技有限公司提供，樣品經(jīng)微波干燥后粉碎過60目篩備用;蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品、D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品由國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心提供;甲醇為色譜純，其余化學(xué)試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蟲草素、蟲草多糖提取率計(jì)算公式及含量測定方法

蟲草素提取率計(jì)算公式:

式中C1為依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的被測液中蟲草素濃度(mg/mL);C2為樣品溶液中蟲草素濃度(mg/mL)。

蟲草多糖提取率計(jì)算公式:

式中C1為依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的被測液中蟲草多糖濃度(mg/mL);C2為樣品溶液中蟲草多糖濃度(mg/mL)。

采用高效液相色譜法(HPLC)測定蟲草素含量，色譜柱為Agilent Eslipse-XDB C18柱;流動相為甲醇-水(12∶88);流速0.8 mL/min;紫外檢測波長260 nm;進(jìn)樣量 10 μL;室溫。

苯酚-硫酸法測定蟲草多糖含量，樣品溶液多糖含量的測定在標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作，測定OD值并得出樣品中蟲草多糖含量。

1.2.2 蟲草素和蟲草多糖綜合提取分離工藝研究

1.2.2.1 提取方法比較實(shí)驗(yàn)

比較水熱回流法和超聲波水提法對綜合提取蟲草素和蟲草多糖的影響。

水熱回流提取法:精確稱取0.10 g冬蟲夏草和1.00 g預(yù)處理后的CSM-8子實(shí)體粉末，按液固比30 mL/g加入蒸餾水熱回流提取6h，HPLC測定蟲草素含量，苯酚-硫酸法測定蟲草多糖含量并計(jì)算提取率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

超聲波水提取法:精確稱取1.00 g預(yù)處理后的CSM-8和0.10 g冬蟲夏草子實(shí)體粉末，按液固比30 mL/g加入蒸餾水超聲波提取30 min，溫度55℃，HPLC測定蟲草素含量，苯酚-硫酸法測定蟲草多糖含量并計(jì)算提取率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2.2 超聲波提取單因素實(shí)驗(yàn)

分別考察超聲溫度(5、30、55、80、90 ℃)、超聲提取時(shí)間(20、40、60、80、100 min)及液固比(10、20、30、40、50 mL/g)、超聲提取次數(shù)(1 次、2 次、3 次、4次、5次)對人工蛹蟲草CSM-8菌株子實(shí)體干粉中蟲草素和蟲草多糖含量的影響。

1.2.2.3 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇對響應(yīng)值(蟲草素和蟲草多糖提取率)有顯著影響的因素，利用Design Expert軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。每一變量的低、中、高水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，模型選用二次方程:

其中Y為響應(yīng)值(蟲草素和蟲草多糖提取率)，β0、β1、β2、β3、β12、β13、β23、β11、β22、β33為方程系數(shù)，x1、x2、x3為自變量編碼值。

通過Box-Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析來進(jìn)一步考察超聲提取時(shí)間、提取溫度和液固比之間的相互影響，并確定超聲波法綜合提取子實(shí)體中蟲草素和蟲草多糖的最佳工藝參數(shù)。

稱取1.00 g CSM-8菌株子實(shí)體粉末和0.10 g冬蟲夏草子實(shí)體粉末，分別按最佳提取工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，HPLC測定蟲草素含量，苯酚-硫酸法測定蟲草多糖含量，并計(jì)算提取率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲草素和蟲草多糖綜合提取分離工藝研究

2.1.1 提取方法比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

比較水熱回流法和超聲波水提法綜合提取蟲草素和蟲草多糖的提取效果，結(jié)果表明(表1):超聲波水提法優(yōu)于水熱回流法，這是因?yàn)槌暡ㄊ咕z細(xì)胞破碎，有利于細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的溶出，使提取效果更好。故選擇超聲波水提法為綜合提取蟲草素和蟲草多糖的方法。

表1 提取方法與蟲草素、多糖提取率的關(guān)系(n=3)Table 1 Comparison of extraction results using water reflux method and Ultrasonication method(n=3)

2.1.2 超聲波提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.2.1 超聲溫度對蟲草多糖和蟲草素含量的影響

在超聲時(shí)間60 min、液固比7.5 mL/g、超聲提取次數(shù)2次的條件下考察微波功率對人工蛹蟲草子實(shí)體中蟲草多糖、蟲草素含量的影響，結(jié)果見表2。確定較優(yōu)草上提取溫度范圍為30～80℃。

表2 超聲溫度對人工蛹蟲草CSM-8菌株子實(shí)體干粉中蟲草多糖、蟲草素含量的影響Table 2 Effect of extraction temperature on the content of polysaccharides，cordycepin in powdered fruit body of CSM-8

2.1.2.2 超聲時(shí)間對蟲草素和蟲草酸含量的影響

在超聲溫度為55℃、液固比7.5 mL/g、提取次數(shù)2次條件下考察超聲時(shí)間對人工蛹蟲草子實(shí)體中蟲草素、蟲草多糖含量的影響，結(jié)果見表3。確定較佳超聲時(shí)間范圍為40～80 min。

表3 超聲時(shí)間對人工蛹蟲草CSM-8菌株子實(shí)體干粉中蟲草多糖、蟲草素含量的影響Table 3 Effect of ultrasonic time on the content of polysaccharides，cordycepin in powdered fruit body of CSM-8

2.1.2.3 液固比對蟲草素和蟲草多糖含量的影響在超聲溫度55℃、超聲時(shí)間60 min、超聲提取次數(shù)2次條件下考察液固比對人工蛹蟲草子實(shí)體中蟲草多糖、蟲草素含量的影響，結(jié)果見表4。確定較優(yōu)液固比范圍為20～40 mL/g。

表4 液固比對人工蛹蟲草CSM-8菌株子實(shí)體干粉中蟲草多糖、蟲草素含量的影響Table 4 Effect of Water/material ratio on the content of polysaccharides，cordycepin in powdered fruit body of CSM-8

表5 提取次數(shù)對人工蛹蟲草CSM-8菌株子實(shí)體干粉中蟲草多糖、蟲草素含量的影響Table 5 Effect of times of extraction on the content of polysaccharides，cordycepin in powdered fruit body of CSM-8

2.1.2.4 超聲提取次數(shù)對蟲草素和蟲草酸含量的影響

在超聲溫度55℃、超聲時(shí)間60 min、液固比30 mL/g條件下考察超聲次數(shù)對人工蛹蟲草子實(shí)體中蟲草多糖、蟲草素含量的影響，結(jié)果見表5。確定較優(yōu)提取次數(shù)為2次。

2.1.3 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.3.1 響應(yīng)曲面法分析因素的選取及分析方案

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上固定提取次數(shù)為2次，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，分別以提取溫度、提取時(shí)間和液固比對應(yīng)3個(gè)獨(dú)立變量X1、X2、X3，并以-1、0、1分別代表變量的水平。

對自變量進(jìn)行編碼(表6)。式中xi為變量的編碼值，Xi為變量的真實(shí)值，X0為實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)變量的真實(shí)值，ΔX為單變量增量，蟲草素和蟲草多糖提取率Y為響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表6和7。

表6 實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼Table 6 Levels and codes of variable chose for Box-Behnken design

2.1.3.2 結(jié)果分析

Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及蟲草素和蟲草多糖提取率的測定結(jié)果見表7。利用Design Expert軟件對表7數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到回歸方程為:

表7 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及蟲草素和蟲草多糖提取率的測定值Table 7 Box-Behnken design and the responses of the total polysaccharide and cordycepin yield

對回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)及方差分析，結(jié)果見表8。由表8得出:兩個(gè)模型的P均＜0.0001，表明兩個(gè)模型都極顯著且失擬項(xiàng)不顯著(模型1，P=0.9388＞0.05;模型2，P=0.3796＞0.05)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9955、R2=0.9888，說明兩個(gè)模型擬合程度都很好。模型的調(diào)整確定系數(shù) AdjR2=0.9897、AdjR2= 0.9745，說明模型 1能解釋98.97%的響應(yīng)值的變化，模型2能解釋97.45%的響應(yīng)值的變化，可以用模型1、2對超聲波水提法綜合提取蟲草素和蟲草多糖提取率進(jìn)行分析及預(yù)測。

表8 回歸模型的方差分析Table 8 ANOVA analysis for response surface quadratic model

模型1回歸方程的系數(shù)顯著性檢驗(yàn)如下:一次項(xiàng)A(P＜0.0001)、C(P＜0.0001)，二次項(xiàng) A2(P＜0.0001)、B2(P＜0.0001)均達(dá)到極顯著水平，一次項(xiàng)B(P=0.0036＜0.01)達(dá)到顯著水平，表明提取溫度、超聲提取時(shí)間、液固比對蟲草素提取率有顯著影響;二次項(xiàng)AB(P=0.0014＜0.0001)、BC(P=0.0050＜0.001)，表明提取溫度與超聲提取時(shí)間、提取時(shí)間與液固比間的交互作用對蟲草素提取率的影響極顯著。

模型2回歸方程的系數(shù)顯著性檢驗(yàn)如下:一次項(xiàng)A(P＜0.0001)、B(P=0.0003＜0.001)，二次項(xiàng) A2(P ＜0.0001)、B2(P ＜0.0001)、C2(P ＜0.0001)均達(dá)到極顯著水平;一次項(xiàng)C(P=0.0020＜0.01)達(dá)到顯著水平，表明提取溫度、超聲提取時(shí)間、液固比對蟲草多糖提取率有顯著影響;二次項(xiàng)AB(P=0.0003＜0.001)、AC(P=0.0383＜0.05)、BC(P=0.0348 ＜0.05)，表明提取溫度與超聲提取時(shí)間、提取溫度與液固比以及提取時(shí)間與液固比的交互作用對蟲草多糖提取率的影響顯著。

利用Design Expert 7.0.0軟件對表4數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程Y1的響應(yīng)面及其等高線見圖1、2和3。

從圖1可知，蟲草素提取率隨提取時(shí)間的延長先升高后下降，呈拋物線趨勢，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到60 min左右時(shí)，提取率達(dá)到最大值，其原因可能是隨著時(shí)間的增大，可溶性成分溶出的越多，使提取液粘度增大，在后期操作中有所損耗;提取時(shí)間和提取溫度的交互作用對蟲草酸素提取的影響顯著，表現(xiàn)為曲面較陡，響應(yīng)值隨提取溫度的變化率大于隨提取時(shí)間的變化率，說明提取溫度對提取率的影響大于超聲提取時(shí)間;蟲草素提取率隨提取溫度的升高而升高，當(dāng)溫度達(dá)到67.5℃后，提取率隨溫度的升高變化不大。圖2可知，提取溫度和液固比的交互作用對蟲草素提取率的影響不顯著，表現(xiàn)為曲面平滑。從圖3可知，提取時(shí)間和液固比對提取率的影響均成拋物線形，即隨提取時(shí)間和液固比的增大，提取率呈先升高后降低的趨勢;提取時(shí)間和液固比的交互作用對蟲草素提取的影響顯著，表現(xiàn)為曲面較陡平滑;響應(yīng)值隨液固比的變化率大于提取時(shí)間，說明液固比對提取率的影響大于提取時(shí)間。

圖1 提取溫度和提取時(shí)間影響蟲草素提取率的等值線與響應(yīng)面Fig.1 Response surface plots(3-D)and contour plots(2-D)showing the effects of variables(X1:extraction temperature;X2:extraction time)on the response Y1

圖2 提取溫度和液固比影響蟲草素提取率的等值線與響應(yīng)面Fig.2 Response surface plots(3-D)and contour plots(2-D)showing the effects of variables(X1:extraction temperature;X3:liquid-solid ratio)on the response Y1

圖3 提取時(shí)間和液固比影響蟲草素提取率的等值線與響應(yīng)面Fig.3 Response surface plots(3-D)and contour plots(2-D)showing the effects of variables(X2:extraction time;X3:liquid-solid ratio)on the response Y1

圖4 超聲提取時(shí)間和提取溫度影響蟲草多糖提取率的等值線與響應(yīng)面Fig.4 Response surface plots(3-D)and contour plots(2-D)showing the effects of variables(X1:extraction temperature;X2:extraction time)on the response Y2

圖5 提取溫度和液固比影響蟲草多糖提取率的等值線與響應(yīng)面Fig.5 Response surface plots(3-D)and contour plots(2-D)showing the effects of variables(X1:extraction temperature;X3:liquid-solid ratio)on the response Y2

圖6 提取時(shí)間和液固比影響蟲草多糖提取率的等值線與響應(yīng)面Fig.6 Response surface plots(3-D)and contour plots(2-D)showing the effects of variables(X2:extraction time;X3:liquid-solid ratio)on the response Y2

利用Design Expert 7.0.0軟件對表4數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程Y2的響應(yīng)面及其等高線見圖4、5和6。從圖4可知，提取時(shí)間和提取溫度的交互作用對蟲草多糖提取的影響較顯著，表現(xiàn)為曲面較陡，響應(yīng)值隨提取溫度的變化率大于隨提取時(shí)間的變化率，說明提取溫度對提取率的影響大于超聲提取時(shí)間;蟲草多糖提取率隨提取時(shí)間的延長先升高后降低，成拋物線趨勢;蟲草多糖提取率隨提取溫度的升高而升高，隨后趨于平緩。從圖5可知，提取溫度和液固比的交互作用對蟲草素提取的影響顯著，響應(yīng)值隨提取溫度的變化率大于隨液固比的變化率，說明提取溫度對提取率的影響大于液固比。從圖6可知，提取時(shí)間和液固比對蟲草多糖提取率的影響均成拋物線形，即隨提取時(shí)間和液固比的同時(shí)增大，提取率呈先升高后降低的趨勢;提取時(shí)間和液固比的交互作用對蟲草多糖提取的影響顯著，表現(xiàn)為曲面較陡;響應(yīng)值隨液固比的變化率大于隨提取時(shí)間的變化率，說明液固比對蟲草多糖提取率的影響大于超聲提取時(shí)間。

利用Design Expert 7.0.0軟件對回歸模型進(jìn)行進(jìn)一步的典型性分析，得到最優(yōu)提取工藝條件為:提取溫度72℃，液固比30 mL/g，提取時(shí)間77 min，提取2次，蟲草素提取率的理論值可達(dá)53.27%，蟲草多糖提取率的理論值可達(dá)41.92%。

2.2 最佳工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

最優(yōu)工藝條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表9所示，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的蟲草素提取率的平均值為50.90%，RSD=1.09%，蟲草多糖提取率的平均值為37.28%，RSD=1.42%，表明二次多項(xiàng)式建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測性，所選工藝條件重現(xiàn)性好。

表9 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 9 Verification of optimal extraction conditions for the total polysaccharide yield(n=3)

2.3 超聲綜合提取冬蟲夏草子實(shí)體中蟲草素和蟲草多糖

表10 超聲提取冬蟲夏草子實(shí)體中蟲草素和蟲草多糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 10 Extraction yields of cordycepin and polysaccharide of C.sinensis using the optimized ultrasonic extraction conditions(n=3)

按照響應(yīng)曲面法確定的最佳提取工藝參數(shù)，稱取0.10 g冬蟲夏草子實(shí)體粉末進(jìn)行超聲提取，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表10。設(shè)定提取溫度73℃，液固比35 mL/g，提取時(shí)間65 min，提取2次，超聲綜合提取冬蟲夏草子實(shí)體中蟲草素的提取率平均值為50.20%，RSD=0.76%，蟲草多糖的提取率平均值為36.92%，RSD=0.64%，表明所選工藝條件重現(xiàn)性好。

3 結(jié)論

綜合提取蟲草素和蟲草多糖工藝條件和路線:采用超聲波提取法進(jìn)行初提，提取液濃縮、醇沉、離心，沉淀用Savage法除蛋白，乙醇分級沉淀獲得蟲草多糖，上清液用大孔樹脂和反相硅膠分離純化，制備型液相色譜分離制備獲得蟲草素。經(jīng)響應(yīng)曲面法確定的最優(yōu)提取工藝條件為:提取溫度72℃，液固比30 mL/g，提取時(shí)間77 min提取2次。以冬蟲夏草和CSM-8菌株為原料，按照最佳提取工藝條件進(jìn)行超聲提取，測得蟲草素提取率平均值分別為50.90%和50.20%，蟲草多糖提取率平均值分別為37.28%和36.92%。

1 Liu DZ(劉東澤)，Chen W(陳偉)，Gao XH(高新華)，et al.Progressofresearch on cordycepin (3.-Deoxyadenosine).Acta Agric Shanghai(上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào))，2004，20(2):89-93.

2 Kim JR，Yeon SH，Kim HS，et al.Larvicidal activity against Plutellaxylostella of cordycepin from the fruiting body of Cordyceps militaris.Pest Manage Sci，2002，58:713-717.

3 Yu RM，Wang L，Zhang H.Isolation，purification and identification of polysaccharides from cultured Cordyceps militaris.Fitoterapia，2004，75:662-666.

4 Cunningham KG，Manson W，Sping FS，et al．Cordycepin，a metabolic product isolated from cultures of Cordyceps militaris.Nature，1950，66:949.

5 Zou XY(鄒向英).Comparative analysis of effective compositions in three Cordyceps.J Northeast Agric Univ(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào))，2010，41:139-142.

6 Chen W(陳偉)，Wu W(吳畏)，Gao XH(高新華)，et al.Study on continuous separation technology of active components from Cordyceps militaris.Acta Agric Shanghai(上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào))，2007，23(3):62-65.

7 Wang YJ(王英娟)，Li DW(李多偉)，Wang YC(王義潮)，et al.Integrated extracting technology of cordycepin and polysaccharides in Cordyceps militaris.Acta Bot Bor-occid Sin(西北植物學(xué)報(bào))，2005，25:1863-1867.

8 Qi B(祁波).Integrated extracting technology of cordycepin and polysaccharides in Cordyceps militaris.Sci Techol Inf(科技信息)，2009:341-343.

9 Wang YF(王永菲)，Wang CG(王成國).The application of response surface methodology.J Central Univ Nation，Nat Sci(中央民族大學(xué)學(xué)報(bào)，自科版)，2005，14:236-240.

10 Chen W(陳偉)，Wu W(吳畏)，Gao XH(高新華)，et al.Research on separation and enrichment of cordycepin by column chromatography.Acta Agric Shanghai(上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào))，2006，22(4):69-71.