銀條多糖SFPSA的單糖組成及抗腫瘤活性研究

馬麗蘋，尤曉顏，原江鋒，汪倫記，曾曉雄

1河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，洛陽 471023;2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 210095

惡性腫瘤，即通常所說的癌癥，其發(fā)病率及死亡率近年來一直呈上升趨勢，按目前趨勢預(yù)測，至2020年隨著世界人口達(dá)80億，將有2000萬新發(fā)癌癥病例，其中死亡人數(shù)將達(dá)1200萬。目前臨床治療癌癥的主要方法是手術(shù)、化療、放療，其共同的特點(diǎn)是在緩解癥狀的同時會給正常機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷。尤其是臨床上廣泛使用的傳統(tǒng)化療藥物普遍存在選擇性差、毒副作用大、易產(chǎn)生耐藥性等問題，大大限制了其在臨床上的應(yīng)用［1］。因此，從天然產(chǎn)物中尋找和篩選專一性高、毒副作用小的抗癌藥物或抗癌輔助藥物已經(jīng)成為目前腫瘤治療的重要研究方向。近年來，大量藥理研究結(jié)果表明，植物多糖不僅具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，而且具有毒副作用小和不易造成殘留等優(yōu)點(diǎn)［2］，因此在醫(yī)療、保健、食品和動物養(yǎng)殖等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

銀條(Stachys floridana Schuttl.ex Benth)，又名銀條菜、銀白條、銀苗、銀根菜和地靈等，屬唇形科水蘇屬多年生草本植物，是以地下莖作為食用器官的偃師地方獨(dú)特蔬菜品種。地下莖白色，肉質(zhì)脆嫩，稍有纖維，味甘，營養(yǎng)豐富，可炒食、鹽漬、醬漬或制成泡菜、蜜餞等，不僅是宴席的珍品，也可作為家常小菜，有消膩去腥的作用，風(fēng)味良好，尤為醬菜中珍品［3］。據(jù)偃師縣志記載，自唐代以來，銀條就已作為歷代宮廷貢品?，F(xiàn)代研究表明，銀條富含碳水化合物、多酚、VC、蛋白質(zhì)和有機(jī)酸，具有降血脂、軟化血管和改善血液循環(huán)的作用［4］。而且，以銀條為原料提取的水蘇糖，有重要的醫(yī)用和藥用價值，也開辟了銀條綜合利用的新途徑［5］。目前對銀條粗多糖的提取工藝和護(hù)肝活性已有研究［6］，而關(guān)于銀條多糖的抗癌活性鮮有報道，因此本研究以銀條多糖純化片段SFPSA作為研究對象，分析其單糖組成，進(jìn)而采用MTT法體外考察了SFPSA對三種癌細(xì)胞系(BGC-823、HGC-27和HT-29)增殖的抑制作用，以期為銀條多糖抗癌活性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

銀條粗多糖按照Ma等［6］(2012)報道的方法通過熱水浸提、超濾濃縮而后醇沉凍干后制得。銀條粗多糖通過DEAE-52陰離子交換柱層析獲得一個主要洗脫成分(由0.3M NaCl洗脫得到)，濃縮凍干后，又將其上樣于Sephadex G-100凝膠柱進(jìn)一步分離純化而得到純化組分SFPSA。BGC-823人胃腺癌細(xì)胞株，由江蘇省藥物研究所饋贈;HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞株，HGC-27人胃癌細(xì)胞株購于上海中科院細(xì)胞庫。

DEAE-纖維素-52凝膠、葡聚糖G-100凝膠、噻唑藍(lán)(MTT)、青霉素-鏈霉素貯存溶液、各單糖(鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖)標(biāo)準(zhǔn)品和葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品購于 Sigma公司。DMEM培養(yǎng)基、新生胎牛血清、丙酮酸鈉溶液、HEPES試劑、臺盼藍(lán)染色劑購于Gibco公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備及試劑

電子天平(AY-120型、BL-220H型，日本SHIMADZU公司);電腦全自動部份收集器(DBS-100A型，上海滬西分析儀器廠);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(Laborota-400型，德國Heidolph公司);冷凍干燥機(jī)(Alpha 1-2型，英國 LABCONCO公司);氣相色譜儀(Agilent 6890N型，美國Agilent公司);高效液相色譜儀(Agilent 1100 Series型，美國Agilent公司);立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-50KBS型，上海申安醫(yī)療器械廠);冷凍離心機(jī)(Megafuge 1.0R型，美國Thermo Scientific公司);超凈工作臺(SW-CJ-2F型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);細(xì)胞培養(yǎng)箱(Series II 3110型，美國Thermo Scientific公司);酶標(biāo)儀(Synergy-2型，美國Biotek公司);渦旋振蕩器(XW-80A，江蘇海門其林貝爾有限公司);細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板(Nunc，美國Thermo Scientific公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 SFPSA的純度鑒定及相對分子質(zhì)量測定

采用高效液相凝膠滲透色譜法(High performance gel permeation chromatography，HPGPC)進(jìn)行多糖樣品的純度鑒定和相對分子質(zhì)量測定，具體方法參照《糖復(fù)合物生化研究技術(shù)》(張惟杰，1999)［7］一書中所述。

1.3.2 SFPSA的單糖組成分析

采用糖腈乙酸酯衍生物法測定SFPSA的單糖組成。具體步驟如下:

1.3.2.1 多糖樣品酸水解

稱取多糖樣品5 mg置安瓿瓶中，加入2 mol/L三氟乙酸(TFA)4 mL后封管，120℃水解2 h，水解液50℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入甲醇約2 mL，再蒸發(fā)至干，如此重復(fù)3次，最后蒸干待作衍生化使用。

1.3.2.2 糖腈乙酸酯衍生物的制備

水解后的糖樣和各標(biāo)準(zhǔn)單糖(鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖)中分別加入10 mg鹽酸羥胺、5 mg肌醇(內(nèi)標(biāo)物)和0.6 mL吡啶，封口，放入90℃水浴中加熱反應(yīng)30 min并振蕩。取出后冷至室溫，再加入1.0 mL醋酸酐，90℃水浴中繼續(xù)反應(yīng)30 min，冷卻后得糖腈乙酸酯衍生物。以肌醇為內(nèi)標(biāo)，反應(yīng)產(chǎn)物直接用于氣相色譜分析。

1.3.2.3 衍生物的氣相色譜檢測

使用Agilent 6890N氣相色譜儀，氫離子火焰檢測器(FID)，Agilent HP-5型5%苯甲基硅氧烷毛細(xì)管色譜柱(30.0 m ×320 μm ×0.25 μm)。具體操作條件如下:N2為載氣，流速1 mL/min;色譜柱程序升溫，120℃保持3 min，以3℃/min速度升溫至210℃，210℃再保持4 min;進(jìn)樣口溫度250℃;檢測器溫度280℃;進(jìn)樣體積1.0～3.0 μL;氮?dú)?、氫氣和空氣的流速分別是25、30、300 mL/min。

1.3.2.4 樣品中單糖的定性和定量

根據(jù)各種單糖標(biāo)準(zhǔn)品在色譜圖中的出峰時間可以對樣品中的單糖進(jìn)行定性分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品、內(nèi)標(biāo)物和樣品中各單糖的峰面積可以對各單糖進(jìn)行定量，計算公式如下:

各單糖校正因子 K=(W標(biāo)準(zhǔn)/W內(nèi)標(biāo))/(A標(biāo)準(zhǔn)/A內(nèi)標(biāo))

樣品中各單糖的質(zhì)量 W樣品=K(A樣品/A內(nèi)標(biāo))× W內(nèi)標(biāo)

其中W標(biāo)準(zhǔn)為上述所稱取的單糖標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量(mg);W內(nèi)標(biāo)為衍生化反應(yīng)時加入的內(nèi)標(biāo)肌醇的質(zhì)量(mg);W樣品為樣品中所含單糖的質(zhì)量(mg);A標(biāo)準(zhǔn)為色譜圖中某單糖標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積;A內(nèi)標(biāo)為色譜圖中內(nèi)標(biāo)肌醇的峰面積;A樣品為樣品色譜圖中某單糖的峰面積。

1.3.3 SFPSA對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

1.3.3.1 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)

腫瘤細(xì)胞參照J(rèn)iang等［8］(2011)報道的方法進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.3.2 MTT法體外檢測SFPSA對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105個/mL，按每孔100 μL的量接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，注意96孔板四周邊孔不接種細(xì)胞，均加入等體積的PBS液體。接種好的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板在37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h。

取出96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用排槍小心吸出培養(yǎng)液，向樣品組孔中加入多糖溶液(用新鮮DMEM完全培養(yǎng)基溶解)100 μL，使得每孔中的多糖終濃度分別為 125、250、500、1000、2000 μg/mL，每個濃度梯度設(shè)6個復(fù)孔。對照組每孔加入100 μL新鮮DMEM完全培養(yǎng)基。

加樣處理后的細(xì)胞于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h，根據(jù)觀測藥物作用效果的需要，選擇在相應(yīng)的培養(yǎng)時間點(diǎn)，于樣品孔和對照孔中加10 μL MTT貯存溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心吸去上清培養(yǎng)液，加入100 μL的DMSO溶解藍(lán)紫色結(jié)晶。輕輕振搖均勻后，在550 nm波長條件下，用酶標(biāo)儀測定各孔的吸光度(Abs)，根據(jù)以下公式計算藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制率:

抑制率(%)=(1-Abs樣品/Abs對照)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 SFPSA的純度及相對分子質(zhì)量

本研究采用高效液相凝膠滲透色譜法鑒定了SFPSA的純度。結(jié)果見圖1。從圖1中可以看出，SFPSA的液相色譜圖上表現(xiàn)為單一的色譜峰，且峰形尖銳，對稱性好。這表明，銀條粗多糖經(jīng)兩步柱層析分離純化后得到了一個分子量相對均一的多糖組分。

HPGFC法分離原理同樣也是據(jù)組分的相對分子量進(jìn)行分離，多糖在排阻色譜柱上的洗脫體積或保留時間與其分子量密切相關(guān)，在一定分子量范圍內(nèi)，洗脫體積或保留時間與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系。因此，本研究以不同分子量的普魯蘭多糖為標(biāo)準(zhǔn)品，通過高效液相凝膠滲透色譜法繪制了相對分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對其進(jìn)行線性回歸方程，回歸方程為:LogMw=-0.2217 RT+7.0983，相關(guān)系數(shù)R2=0.9945。其中Mw為標(biāo)樣的已知平均相對分子量，RT為標(biāo)樣的保留時間。銀條多糖純化組分SFPSA的高效液相凝膠滲透色譜圖如圖1所示。由圖1可知，它在高效液相色譜圖上的保留時間為:8.203 min。將保留時間值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到它們的相對平均分子質(zhì)量是168.30 kDa。

圖1 銀條多糖純化組分SFPSA相對分子質(zhì)量的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of relative molecular weight of SFPSA

2.2 SFPSA的單糖組成

圖2 單糖標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖Fig.2 GC spectrum of monosaccharide standards

圖3 SFPSA單糖組成的氣相色譜圖Fig.3 GC spectrum of monosaccharide composition of SFPSA

本文采用糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜法對銀條酸性多糖SFPSA的單糖組成進(jìn)行了測定。標(biāo)準(zhǔn)單糖糖腈乙酸脂衍生物氣相色譜圖如圖2所示。在圖2中，它們在氣相色譜圖上的保留時間依次為L-鼠李糖(RT，20.666)、L-阿拉伯糖(RT，21.325)、L-巖藻糖(RT，21.614)、D-木糖(RT，21.907)、D-甘露糖(RT，28.706)、D-葡萄糖(RT，29.078)、D-半乳糖(RT，29.818)、肌醇(RT，33.194)。

SFPSA完全酸水解的GC圖如圖3所示。比對標(biāo)準(zhǔn)單糖在氣相色譜圖(圖2)上的出峰時間，即可獲得各樣品中單糖種類的信息;根據(jù)色譜圖上的峰面積，再依據(jù)內(nèi)標(biāo)法結(jié)合矯正系數(shù)K即可計算出純化組分的單糖組成的摩爾比。SFPSA主要含有由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖等單糖組分，其摩爾百分比為:8.19∶37.74∶3.46∶50.61。

2.3 銀條多糖SFPSA體外對三種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

將不同濃度的銀條多糖SFPSA加入到BGC-823、HGC-27和HT-29三種癌細(xì)胞中，分別作用24、48、72 h，以研究其對這三種癌細(xì)胞增殖活性的影響，結(jié)果見圖4、圖5和圖6。由圖4可知，當(dāng)SFPSA的終濃度為125 μg/mL，給藥時間為24 h時，SFPSA對BGC-823細(xì)胞增殖的抑制作用較弱，抑制率僅為3.89%，而當(dāng)藥物作用72 h時，SFPSA對BGC-823細(xì)胞增殖的抑制作用增加，抑制率為30.33%。藥物處理72 h時，當(dāng)藥物濃度由125 μg/mL增加到2000 μg/mL，其對BGC-823細(xì)胞增殖的抑制率也由30.33%增加到38.37%。以上結(jié)果說明銀條多糖SFPSA對人胃腺癌BGC-823細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用，而且這種作用隨著時間的延長和濃度的增加而增加，即呈現(xiàn)一定的時間和濃度的依賴關(guān)系。

圖4 銀條多糖SFPSA對人胃腺癌細(xì)胞BGC-823增殖的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of SFPSA on the proliferation of human gastric cancer BGC-823 cells

圖5 銀條多糖SFPSA對人胃腺癌細(xì)胞HGC-27增殖的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of SFPSA on the proliferation of human gastric cancer HGC-27 cells

由圖5可知，當(dāng)SFPSA的終濃度為125 μg/mL，給藥時間為24 h時，SFPSA對HGC-27細(xì)胞增殖的抑制作用較低，抑制率為18.39%，而當(dāng)SFPSA濃度增加到2000 μg/mL時，其對HGC-27的抑制率便提高到47.20%。藥物處理72 h后，當(dāng)藥物濃度由125 μg/mL 增加到 2000 μg/mL，SFPSA 對 HGC-27細(xì)胞增殖的抑制率由47.20%增加到55.72%。結(jié)果表明銀條多糖SFPSA也能抑制人胃腺癌HGC-27細(xì)胞的增殖，且這種抑制作用也呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系和時效關(guān)系。但要比同一濃度同一時間下對BGC-823細(xì)胞的抑制率要高，說明HGC-27對SFPSA的敏感程度比BGC-823要高。

圖6 銀條多糖SFPSA對人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of SFPSA on the proliferation of human colon cancer HT-29 cells

由圖6可知，銀條多糖SFPSA對人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用也呈現(xiàn)一定的量效和時效關(guān)系。125 μg/mL的SFPSA作用24 h后，其抑制率為17.25%，而當(dāng) SFPSA濃度增加到2000 μg/mL時，其抑制率提高到32.97%，比SFPSA對HGC-27細(xì)胞的抑制作用的增幅要大。2000 μg/mL的SFPSA分別作用24、48和72 h后，其對HT-29細(xì)胞的抑制率從44.69%增加到64.68%，即呈現(xiàn)時效關(guān)系。

研究表明，多糖的抗腫瘤活性受到多糖分子量、單糖組成等因素影響。而高分子量和高半乳糖含量等特性均有助于多糖抗腫瘤活性的發(fā)揮［9，10］。而本研究中的SFPSA同時具有高分子量和高半乳糖含量的特性，這可能是其具有抗腫瘤活性的原因之一。以上結(jié)果表明銀條多糖SFPSA對BGC-823、HGC-27和HT-29三種癌細(xì)胞的增殖均有較好的抑制作用，且抑制能力存在劑量和時間的依賴關(guān)系，為了更加直觀的比較三種癌細(xì)胞對SFPSA敏感程度的差異，我們將它們的半數(shù)抑制濃度IC50計數(shù)出來，如表1所示。在給藥處理24、48、72 h后，SFPSA對HT-29均具有最低的IC50值，分別為:2438.38、908.624和407.52 μg/mL。根據(jù)IC50值的高低，可以得出三種癌細(xì)胞對SFPSA的敏感程度由強(qiáng)到弱的順序關(guān)系:HT-29＞HGC-27＞BGC-823。有關(guān)SFPSA抑制人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

表1 銀條多糖SFPSA對不同癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度Table 1 50%concentration of inhibition of SFPSA on different cancer cells

3 結(jié)論

從銀條粗多糖中分離純化得到的SFPSA片段為分子量相對均一的雜多糖，其相對重均分子量為168.30 kDa。糖腈乙酰酯化法分析銀條多糖SFPSA單糖組成的結(jié)果表明，SFPSA中含鼠李糖，阿拉伯糖，葡萄糖和半乳糖等單糖組分，其摩爾百分比為8.19∶37.74∶3.46∶50.61。SFPSA 對人胃腺癌 BGC-823、HGC-27和人結(jié)腸癌HT-29三種癌細(xì)胞的增殖均有抑制作用，且這種增殖抑制作用呈現(xiàn)一定的的量效和時效關(guān)系。通過比較SFPSA對三種癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)可知，人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞對SFPSA最為敏感，可作為下一步SFPSA抗癌機(jī)理的研究對象。

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