巴戟天配伍維生素C對大鼠運動性腎臟缺血再灌注的保護作用

郭愛民，曹建民，周海濤

1中國石油大學(xué)(北京)，北京102249;2北京體育大學(xué)，北京 100084;3北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023

隨著現(xiàn)代中醫(yī)藥理論的發(fā)展、現(xiàn)代藥理學(xué)理論及現(xiàn)代生物技術(shù)的更新，更多的單劑或配伍組方應(yīng)用于體育實踐。中藥以其多靶點、多途徑作用且?guī)缀醪缓`禁成分的特點日益顯示出其獨特的優(yōu)勢，在提高運動員身體機能及緩解疲勞方面取得了一定的成就。

機體在穩(wěn)定狀態(tài)下，腎血流量可以通過自身調(diào)節(jié)機制來維持相對恒定。在劇烈運動時，腎血流在神經(jīng)和體液因素的影響下發(fā)生改變。由于各器官血流量重新分配，使活動器官特別是肌肉的血流量增多，腎血流量急劇下降，并伴隨運動過程的持續(xù)和強度遞增表現(xiàn)的更加明顯［1］。腎臟的這種不完全缺血狀態(tài)形成了“運動性腎缺血”。運動停止后，腎血供應(yīng)恢復(fù)形成運動性腎缺血后的“再灌注”［2］。缺血再灌注損傷過程中，自由基的產(chǎn)生異常增多起著重要作用。研究表明，巴戟天具有提高過氧化物歧化酶活性、降低脂質(zhì)過氧化物的藥理作用［3］，維生素C作為體內(nèi)重要的抗氧化劑，可以有效清除自由基［4］。本文研究巴戟天配伍維生素C對大鼠缺血再灌注腎臟的影響，并探討二者在缺血再灌注損傷中的作用及其機制，旨在為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 試驗動物

清潔級雄性Wistar大鼠100只，42 d齡，平均體重(196.7±12.1)g，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供，許可證號SCXK(京)2006-0008。在整個試驗過程中，實驗室內(nèi)溫度保持在(22±2)℃，相對濕度55%～75%，光照時間隨自然變化。所有試驗大鼠均以基礎(chǔ)飼料(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供)和蒸餾水常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食。試驗時間為63 d，正式訓(xùn)練時間為56 d。

1.2 試驗用藥

巴戟天(Morindae Officinalis)，產(chǎn)自廣東肇慶，北京同仁堂購得，批號:100156357，并經(jīng)天津中瑞藥業(yè)有限公司高占友高級工程師鑒定。稱取巴戟天50 g加7倍水，浸泡90 min后煎30 min，將所得水煎液過濾，再將過濾出的巴戟天加4倍水，煎30 min，將所得水煎液過濾。將2次過濾出的水煎液混合，濃縮到50 mL置于三角瓶內(nèi)。最后將制備好的所有藥液放入4℃冰箱冷凍保存，即為巴戟天煎劑1 g(生藥)/mL。

1.3 試劑

血清肌酐(Cr)采用Jaffe苦味酸法測定，血尿素氮(BUN)采用二乙酰-肟法測定，丙二醛(MDA)采用比色法測定;超氧化物歧化酶(SOD)，采用黃嘌呤氧化酶法測定，均采用南京建成生物工程研究所提供試劑盒，試劑盒編號20120509，并嚴格按照使用說明操作。

1.4 儀器

BS224S型電子分析天平(德國賽多利斯);光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司);ALCYON300全自動生化分析儀(美國雅培);756M C型紫外-可見分光光度計(上海精密儀器廠);GL-20G高速冷凍離心機(上海安亭)。

2 試驗方法

2.1 動物分組

實驗大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d后，以20 min/d的運動量對其進行為期3 d的篩選，淘汰個別不適應(yīng)游泳訓(xùn)練者，將剩余大鼠以數(shù)字隨機分組法分6組:對照組(C組)12只，一般訓(xùn)練組(M組)12只，過度訓(xùn)練組(OM組)24只，巴戟天+過度訓(xùn)練組(MOM組)16只，維生素C+過度訓(xùn)練組(VCOM組)16只，巴戟天+維生素C+過度訓(xùn)練組(MVCOM組)16只進行56 d的游泳訓(xùn)練。訓(xùn)練期間，MOM組、MVCOM組采用專業(yè)灌胃器灌胃(ig)，每天一次，劑量為1 g/kg，ig體積為5 mL/kg;VCOM組、MVCOM組采用腹腔注射(ip)，劑量為100 mg/kg，每天一次，注射體積為0.5 mL(通過預(yù)實驗獲得最佳劑量)，其他各組ig等量生理鹽水。

2.2 實驗方法。

2.2.1 訓(xùn)練及測試方案

C組常規(guī)飼養(yǎng)，不加任何干預(yù)，平時不運動。M組進行中等強度游泳訓(xùn)練，正式游泳訓(xùn)練8周。每周訓(xùn)練6 d，每天訓(xùn)練1次，第一次下水游20 min，此后逐漸增加，至第1周末時每天游60 min，第2周末時加至每天游90 min，第3周末時加至每天游120 min，此后5周均保持此運動量。其他各組前3周訓(xùn)練安排同M組，第4周起開始安排高強度訓(xùn)練。大鼠進行負重游泳，每次訓(xùn)練至力竭。力竭標準以大鼠下沉后10 s不露出水面為度。第1～3周負0.5%體重，第4周負1%體重，第5周負2%體重，每天訓(xùn)練1次。第6周每天上、下午各訓(xùn)練1次，第7～8周，每天上、下午、夜間各訓(xùn)練1次，均負5%體重。至第8周末，C、M組大鼠，均正常生長，無意外死亡發(fā)生。其他各組大鼠因尾部負重，疲勞衰竭不能恢復(fù)及訓(xùn)練意外死亡等原因，死亡率較高。OM組、MOM組、VCOM組、MVCOM 組分別剩余14、12、11、13只。各組分別取10只用于實驗取材，其他隨機剔除。

2.2.2 指標測定

各組大鼠于末次游泳訓(xùn)練24 h后，乙醚適度麻醉，從頸總動脈處取血加入檸檬酸鈉溶液抗凝，37℃水浴中30 min后，4℃ 3000 rpm離心10 min，分離制備血清，置-20℃冰箱中保存待查。迅速取雙腎，剔除筋膜，置于預(yù)冷的生理鹽水中洗凈血污，肉眼觀察腎臟大小，色澤、質(zhì)地。分離左腎，取腎上極組織0.5 g，用1.5 mL生理鹽水在1℃下以12000 r/min研磨制成10%腎組織勻漿;10%甲醛固定腎組織標本，石蠟包埋，制成4 μm厚切片，HE染色，觀察組織病理學(xué)變化。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS12.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行處理，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 試驗結(jié)果

3.1 運動及巴戟天、維生素C對大鼠腎組織的病理改變

Scr和BUN測定后取各組腎組織制作石蠟切片，進行HE染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化，腎臟病理變化評價參照Pallers標準［5］，在400倍光鏡下隨機選5個視野，每個視野選10個腎小管評分。1、腎小管明顯擴張，細胞扁平為1分;2、刷狀緣損傷為1分，脫落為2分;3、細胞膜大泡1分，細胞漿空泡1分;4、間質(zhì)水腫1分;5、腎小管腔內(nèi)有脫落的壞死細胞未形成管型或碎片為1分，形成管型或碎片為2分。腎小管評分由兩名技術(shù)員雙盲計算，取其平均值。光鏡下靜止對照組、一般訓(xùn)練組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，無淤血、變性和水腫，腎小管管腔內(nèi)無管型。過度訓(xùn)練組大鼠腎小球有淤血現(xiàn)象，小管上皮細胞水腫、空泡變性、管腔擴張，管腔中有少量的脫落絨毛和上皮細胞，以及各種管型。其他各組組織病理學(xué)改變較過度訓(xùn)練組輕，有輕微的小管上皮細胞水腫、空泡變性，管腔擴張現(xiàn)象，無蛋白管型和細胞管型。各組大鼠腎小管Paller［5］評分，靜止對照組、一般訓(xùn)練組組間無顯著差異(P＞0.05)，靜止對照組、一般訓(xùn)練組明顯低于其他組(P＜0.01)，治療組顯著低于過度訓(xùn)練組大鼠(P＜0.05)，且均未見腎小球明顯病理改變。

表1 各組大鼠腎小管損害評分比較(n=10，±s)Table 1 Tubular damage score in various groups of rats(n=10，±s)

表1 各組大鼠腎小管損害評分比較(n=10，±s)Table 1 Tubular damage score in various groups of rats(n=10，±s)

注:與C組比較，1)表示P＜0.05，2)表示P＜0.01;與OM組比較，3)表示 P ＜0.05，4)表示 P ＜0.01。Note:compared with C group，1)and2)represent P ＜0.05 and P ＜0.01，respectively;compared with OM group，3)and4)represent P ＜0.05 and P＜0.01，respectively.

組別Groups腎小管損害評分Tubular damage score(scores/HP)C group 2.49±1.75 M group 2.88±1.524)OM group 12.86±1.892)MOM group 10.24 ± 1.482，3)VCOM group 10.98 ± 1.252，3)MVCOM group 9.53 ± 1.652，3)

3.2 運動及巴戟天、維生素C對大鼠血清BUN和SCr的影響

表2 各組大鼠血清尿素氮和肌酐含量比較(n=10，±s)Table 2 Blood urea nitrogen(BUN)and serum creatinine(SCr)levels in plasma of different groups(n=10，±s)

表2 各組大鼠血清尿素氮和肌酐含量比較(n=10，±s)Table 2 Blood urea nitrogen(BUN)and serum creatinine(SCr)levels in plasma of different groups(n=10，±s)

注:與C組比較，1)表示P＜0.05，2)表示P＜0.01;與OM組比較，3)表示P ＜0.05，4)表示P ＜0.01;與VCOM 組比較，5)表示P ＜0.05，6)表示P＜0.01。Note:compared with C group，1)and2)represent P ＜0.05 and P ＜0.01，respectively;compared with OM group，3)and4)represent P ＜0.05 and P＜0.01，respectively;compared with VOCM group，5)and6)represent P ＜0.05 and P ＜0.01，respectively.

組別Groups血清尿素氮BUN(mmol/L)血清肌酐SCr(μmol/L)C group 8.28±1.14 30.74±9.83 M group 9.05 ± 1.031，4) 36.29 ± 9.371，4)OM group 15.02±1.142) 79.54±10.342)MOM group 10.54 ± 1.232，3，5) 65.08 ± 9.852，3，5)VCOM group 11.45 ± 1.332，3) 69.75 ± 13.042，3)MVCOM group 10.53 ± 1.071，4，6) 56.09 ± 12.451，4，6)

由表2可知:血尿素氮和血清肌酐各組較對照組明顯上升，與OM組相比MOM組、VCOM組、MVCOM組明顯下降(分別為 P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01);與VCOM組相比，MOM組、MVCOM組明顯下降(分別為 P＜0.05，P＜0.01)。

3.3 運動及巴戟天、維生素C對大鼠腎組織勻漿中SOD活性和MDA含量的影響

表3 各組大鼠腎組織勻漿中SOD活性和MDA含量比較(n=10，±s)Table 3 Comparison of SOD activity and MDA content in rat kidney homogenate of each group(n=10，±s)

表3 各組大鼠腎組織勻漿中SOD活性和MDA含量比較(n=10，±s)Table 3 Comparison of SOD activity and MDA content in rat kidney homogenate of each group(n=10，±s)

注:與C組比較，1)表示P＜0.05，2)表示P＜0.01;與OM組比較，3)表示P ＜0.05，4)表示P ＜0.01;與VCOM 組比較，5)表示P ＜0.05，6)表示P＜0.01。Note:compared with C group，1)and2)represent P ＜0.05 and P ＜0.01，respectively;compared with OM group，3)and4)represent P ＜0.05 and P＜0.01，respectively;compared with VOCM group，5)and6)represent P ＜0.05 and P ＜0.01，respectively.

組別Groups超氧化物歧化酶SOD(U/mgprotmol)丙二醛MDA(U/mgprotmol)C group 105.15±3.27 10.09±1.48 M group 93.33 ± 2.652，3) 17.04 ± 1.622，3)OM group 75.22±1.142) 30.54±1.582)MOM group 84.64 ± 1.532，3，5) 21.08 ± 1.552，3，5)VCOM group 80.19 ± 1.292，3) 25.45 ± 1.442，3)MVCOM group 90.47 ± 1.561，4，6) 15.99 ± 1.351，4，6)

由表3可知:SOD活性各組較對照組明顯降低，與OM組相比MOM組、VCOM組、MVCOM組明顯上升(分別為 P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01);與VCOM組相比，MOM組、MVCOM組明顯上升(分別為P＜0.05、P＜0.01)。MDA含量各組較對照組明顯升高，與OM組相比MOM組、VCOM組、MVCOM組明顯下降(分別為P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01);與VCOM組相比，MOM組、MVCOM組明顯降低(分別為 P＜0.05、P＜0.01)。

4 討論

腎缺血再灌注(Ischemic reperfusion，I/R)損傷是一個復(fù)雜的病理生理變化過程，其具體機制尚未完全闡明。但氧自由基(Oxygen free radicals，OFR)在I/R發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用［6］。正常情況下，體內(nèi)可產(chǎn)生少量自由基，但由于體內(nèi)具有滅活自由基酶系統(tǒng)，自由基被迅速清除，不產(chǎn)生損傷作用。運動時由于I/R使自由基產(chǎn)生增加，可引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致膜的液態(tài)性、流動性及通透性改變，進而造成膜功能障礙，尤其是線粒體膜的破壞將影響細胞的代謝和機能，并干擾整個器官的生理功能。機體內(nèi)存在清除自由基、減輕其危害的主要物質(zhì)是抗氧化酶。SOD是需氧生物體內(nèi)數(shù)千種酶中以氧自由基為底物的唯一酶。其通過催化超氧陰離子形成過氧化氫而清除超氧陰離子，保護機體免受損傷，同時在一定范圍內(nèi)，自由基代謝增強時，SOD會代償性增加。因此SOD活性的高低是機體抗氧化能力強弱的標志。MDA是細胞脂質(zhì)過氧化的一種主產(chǎn)物。組織線粒體MDA含量是目前公認的衡量機體自由基代謝的敏感指標［7］。肌酐和尿素氮分別是肌肉和蛋白質(zhì)的分解代謝產(chǎn)物，主要經(jīng)血循環(huán)從腎臟排除體外，其血中的濃度取決于腎小球濾過能力，當腎臟實質(zhì)受到損傷，腎小球濾過率降到臨界點后，二者的濃度就會明顯上升［8］。

實驗結(jié)果顯示，8周的過度訓(xùn)練導(dǎo)致大鼠腎組織組織病理學(xué)發(fā)生明顯改變;血尿素氮、血清肌酐增高［過度訓(xùn)練組(P＜0.01)、巴戟天+過度訓(xùn)練組(P＜0.01)、維生素C+過度訓(xùn)練組(P＜0.01)、巴戟天+維生素C+過度訓(xùn)練組(P＜0.05)高于靜止對照組］;SOD活性降低［過度訓(xùn)練組(P＜0.01)、巴戟天+過度訓(xùn)練組(P＜0.01)、維生素C+過度訓(xùn)練組(P＜0.01)、巴戟天+維生素C+過度訓(xùn)練組(P＜0.05)低于靜止對照組］;MDA含量升高［一般訓(xùn)練組(P＜0.05)、過度訓(xùn)練組(P＜0.01)、巴戟天+過度訓(xùn)練組(P＜0.01)、維生素C+過度訓(xùn)練組(P＜0.01)、巴戟天+維生素C+過度訓(xùn)練組(P＜0.05)高于靜止對照組］。說明過度訓(xùn)練已造成大鼠腎臟運動性缺血“再灌注”損傷，腎功能受到嚴重損壞。但腎組織組織病理學(xué)改變巴戟天+過度訓(xùn)練組、維生素C+過度訓(xùn)練組、巴戟天+維生素C+過度訓(xùn)練組(P＜0.05)較過度訓(xùn)練組明顯減輕。血尿素氮和血清肌酐含量巴戟天+過度訓(xùn)練組(P＜0.05)、維生素C+過度訓(xùn)練組(P＜0.05)、巴戟天+維生素C+過度訓(xùn)練組(P＜0.01)低于過度訓(xùn)練組;SOD活性，巴戟天+過度訓(xùn)練組(P＜0.05)、維生素C+過度訓(xùn)練組(P＜0.05)、巴戟天+維生素C+過度訓(xùn)練組(P＜0.01)高于過度訓(xùn)練組;MDA含量，巴戟天+過度訓(xùn)練組(P＜0.05)、維生素C+過度訓(xùn)練組(P＜0.05)、巴戟天+維生素C+過度訓(xùn)練組(P＜0.01)低于過度訓(xùn)練組。表明，巴戟天及維生素C可以有效清除自由基，減輕腎臟的缺血缺氧，抑制脂質(zhì)過氧化作用，提高SOD活性。有效減輕腎臟缺血再灌注損傷，起到保護作用。其機制可能為:1、巴戟天中的主要成分巴戟天多糖對物理的、化學(xué)的及生物來源的多種活性氧(ROS)具有清除作用，能減輕脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的生成量，提高超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和穩(wěn)定細胞膜的作用，從而促進大鼠運動缺血再灌注損傷［9］;2、巴戟天中富含Vc及Mn等多種微量元素，可以通過減少機體超氧陰離子自由基的生成，而使SOD的消耗相應(yīng)降低［3］。二方面的聯(lián)合作用對清除機體自由基、減輕自由基對線粒體膜和肌漿網(wǎng)膜造成損傷起到積極作用;3、維生素C是重要的抗氧化維生素，作為強抗氧化劑可有效清除氧自由基、抑制凋亡級聯(lián)的啟動而減輕細胞、器官的缺血再灌注損傷［10］。此外，3個治療組間比較，血尿素氮、血清肌酐、MDA含量，巴戟天+過度訓(xùn)練組(P＜0.05)，巴戟天+維生素C+過度訓(xùn)練組(P＜0.01)低于維生素C+過度訓(xùn)練組;SOD活性，巴戟天+過度訓(xùn)練組(P＜0.05)，巴戟天+維生素C+過度訓(xùn)練組(P＜0.01)高于維生素C+過度訓(xùn)練組。提示巴戟天對缺血再灌注損傷腎臟的療效可能優(yōu)于維生素C;而二者配伍使用可使血尿素氮，血清肌酐水平含量低于單純使用巴戟天，使SOD活力增高，提示二者配伍使用可能更有利于缺血再灌注損傷腎臟的保護。

綜上所述，巴戟天和維生素C均對腎臟缺血再灌注損傷具有保護作用，可能是通過增強超氧化物歧化酶活性，清除自由基，減輕脂質(zhì)過氧化作用，進而改善腎臟功能。就療效而言，二者配伍使用優(yōu)于二者單獨應(yīng)用，而巴戟天又優(yōu)于維生素C，但也可能和二者在應(yīng)用中的劑量大小有關(guān)，其劑量和療效之間的關(guān)系，還有待進一步研究。

1 Barclar WF.Review of Medical Physiology.California:Lange Medical Publication.1995:577-580.

2 Heifets M，Davis TA，Tegtmeyer E，et al.Exercise training ameliorates progressive renal disease in rats with subtotal nephrectomy.Kidney Int，1987，32:815-820.

3 Zhu C(朱超)，Cao JM(曹建民)，Zhou HT(周海濤)，et al.Effect of Radix morinda officinalis on the exercise capacity in rats and oxidation resistance of mitochondrial.Chin J Exp Tradit Med Form(中國實驗方劑學(xué)雜志)，2013，19:219-222.

4 Palazzetti S，Rousseau AS，Richard MJ，et al.Antioxidant supplementation preserves antioxidant response in physical training and low antioxidant intake.Br J Nutr，2004，91:91-100.

5 Glaumann B，Trump BF.Studies on the pathogenesis of ischemic cell injury.III.Morphological changes of the proximal pars recta tubules(P3)of the rat kidney made ischemic in vivo.Virchows Arch B Cell Pathol，1975，19:303-323.

6 Wang L(王麗)，Mei CL(梅長林).Hypoxia-inducible factor-1α and oxygen free radicals in renal ischemia-reperfusion injury in rats.Chin J Nephrol(中華腎臟病雜志)，2006，22:371-373.

7 Chen PJ，Hirata F.The effects of long-term training at various loads on immunity and neuroendocrine responses in rats.J Nat Inst Fit Sport Kanoya Japan，1998，20:19-26.

8 Hong P(洪平)，Chen G(陳耿)，Li QZ(李清正)，et al.Influence of rapid weight loss by different temperature on certain biochemical indexes.Chin Sport Sci(體育科學(xué))，2010，30(4):44-48.

9 Liu X(劉霄).The Morinda polysaccharide hypoglycemic and antioxidant effects research.Chin Med Mat(中藥材)，2009，32:949-951.

10 Korkmaz A，Kolankaya D.The protective effects of ascorbic acid against renal ischemia-reperfusion injury in male rats.Ren Fail，2009，31:36-43.