齊墩果烷及熊果烷型五環(huán)三萜抗肝損傷作用及其構(gòu)效關(guān)系研究

寧 娛，張 潤，鄒子軍，孫 洋，陳杰桃，林朝展*，熊天琴，祝晨蔯*

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)臨床藥理研究所，廣州 501045;2廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006

齊墩果烷型和熊果烷型五環(huán)三萜類化合物是廣泛存在于植物中的次生代謝產(chǎn)物，近年來的研究表明，該兩類成分具有較好的抗肝損傷活性［1，2］，可通過促進肝細(xì)胞再生，使壞死區(qū)迅速修復(fù)、降低肝組織炎癥反應(yīng)、抑制膠原纖維增生等途徑，從而發(fā)揮保肝作用。目前已有齊墩果酸、甘草甜素等作為保肝藥物在臨床上分別用于急性黃疸型肝炎和病毒性肝炎的治療。因此，植物來源的三萜類化合物在開發(fā)保肝新藥方面顯示了巨大的潛在優(yōu)勢。

已有文獻研究報道，紫珠屬(Callicarpa)、香茶菜屬(Isodon)植物中多含有三萜類成分［3，4］，而本課題組長期對上述2屬的3種廣東地區(qū)習(xí)用藥材枇杷葉紫珠、裸花紫珠和狹基線紋香茶菜中五環(huán)三萜化合物進行系統(tǒng)的分離鑒定研究，得到32個五環(huán)三萜類化合物［5，6］，采用葡萄糖氧化酶GO造氧化肝損傷細(xì)胞模型，檢測五環(huán)三萜類單體化合物對肝損傷細(xì)胞的保護活性，同時利用目前最常用的3D-QSAR方法——比較分子力場分析(Comparative Molecular Field Analysis，CoMFA)［7，8］研究三萜類化合物分子結(jié)構(gòu)參數(shù)與氧化肝損傷細(xì)胞保護活性之間的三維定量關(guān)系，并建立相應(yīng)的結(jié)構(gòu)活性關(guān)系模型，以期為深入研究其保護機制、設(shè)計高活性保肝藥提供基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

熔點用X6顯微熔點測定儀測定(北京泰克儀器有限公司);NMR用AVANCE AV 400超導(dǎo)核磁共振儀(瑞士Bruker)測定;TMS內(nèi)標(biāo);MS用Agilent QQQ 1260-6460(液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀)，Agilent公司(美國)。柱層析硅膠和薄層層析硅膠(青島海洋化工廠);所有分離用有機溶劑均為國產(chǎn)分析純(廣州化學(xué)試劑廠);反相硅膠:RP-C18(40～63 μm)。氘代試劑:吡啶(NORELL，USA)，甲醇和氯仿(Cambridge Isotope Laboratories，USA)。

實驗所用枇杷葉紫珠、裸花紫珠和狹基線紋香茶菜分別采自從化國家森林公園、海南臨高裸花紫珠種植基地和清遠(yuǎn)狹基線紋香茶菜GAP種植基地，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)教研室潘超美教授鑒定學(xué)名為馬鞭草科(Verbenaceae)紫珠屬(Callicarpa L.)植物枇杷葉紫珠(C．konchiana Makino)、裸花紫珠(C．nudiflora Hook.et Arn)和唇形科(Labiatae)香茶菜屬(Isodon)植物狹基線紋香茶菜(I．lophanthoides var．gerardianus)，憑證標(biāo)本現(xiàn)保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院藥物分析研究室(憑證標(biāo)本:No.CKM071005;CNF081003;ILG080916)，晾干，粉碎成粗粉，備用。

2 提取與分離

取枇杷葉紫珠、裸花紫珠和狹基線紋香茶菜粗粉各10.0 kg，分別用甲醇(150～200 L)進行滲漉提取，將提取液減壓濃縮。將濃縮液混懸于6.0～10.0 L蒸餾水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，將萃取液分別進行減壓濃縮得到各部位浸膏。每個乙酸乙酯部位運用硅膠柱色譜法進行分離，用氯仿-甲醇梯度洗脫，適當(dāng)合并為若干個流份。根據(jù)流份的具體情況，再選用重結(jié)晶、硅膠柱色譜、反相硅膠柱色譜、葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜等方法反復(fù)分離純化。分別得到五環(huán)三萜化合物1～32，純度經(jīng)過HPLC面積歸一化法測定，均大于99%。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

本研究從枇杷葉紫珠、裸花紫珠和狹基線紋香茶菜三種藥用植物中總共分離得到32個三萜類化合物(見表1和表2)，該類成分大部分為三萜苷元，共有25個，只有7個以苷的形式存，分離的三萜類化合物分別屬于齊墩果烷型(10個):齊墩果酸(oleanolic aicd，1)、2α，3β，23-三羥基齊墩果烷-12烯-28-酸-O-β-葡萄 糖 酯 (2α，3β，23-trihydroxy-12-ene-28-oic-O-β-D-glucopyranoside，2)、2α，3β-二羥基-12-烯-28-齊墩 果 酸 (2α，3β-dihydroxyolean-12-ene-28-oic acid，3)、2α，3β，23-三羥基-12-烯-28-齊墩果酸(hyptatic acid，4)、2α，3β，19α，23-四羥基-12-烯-28-齊墩果酸(2α，3β，19α，23-tetrahydroxy-12-ene-28-oic-acid，5)、2α，3β，23，29-四羥基-12-烯-28-齊墩果酸(stachlic acid A，6)、常春藤皂苷元(hederagenin，7)、3-乙酰齊墩果酸(3-acetyl oleanolic acid，8)、2α，3β，19α，23-四羥基-12-烯-28-齊墩果酸-β-D-葡萄糖-(1→4)-β-D-葡萄糖酯 (2α，3β，19α，23-tetrahydroxyolean-12-en-28-oic acid-28-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-Dglucopyranoside，9)、3-O-β-D-葡萄糖-α-香樹脂醇苷(α-amyrin-3-O-β-D-glucopyranosides，10);熊果烷型(22個):3β-乙酰氧基熊果烷-12-烯-28醇(3β-acetoxy-28-hydroxyurs-12-ene，11)、α-香樹脂醇乙酸乙酯(α-amyrin acetate，12)、3β-乙酰氧基-12-烯-28 熊果酸(3β-acetoxy-28-oic acid-12-ene，13)、3β，19α-二羥基-12 烯-28 熊果酸(3β，19α-dihydroxyurs-12-ene-28-oic acid，14)、3β，19α-二羥基熊果烷-12 烯-24，28-二 醇 (3β，19α-dihydroxy-24，28-hydroxyurs-urs-12-ene，15)、2α，3β，19α-三羥基熊果烷-12 烯-24，28-二酸(2α，3β，19α-trihydroxy-urs-12-ene-23，28-dioic acid，16)、3-O-β-L-阿拉伯糖-19α-羥基熊果烷-12 烯-28-酸-甲酯(3-O-β-L-arabinopyranosyl-19α-hydroxy-urs-12-ene-28-O-acid methylester，17)、3-O-β-D-木糖-19α-羥基熊果烷-12 烯-28-酸-O-β-D-葡萄糖酯 (3-O-β-D-xylpyranosyl-19α-dihydroxyurs-12-ene-28-O-β-D-glycopranoside，18)、2α，3-O-β-D-葡萄糖醛酸-19α-羥基-12 烯-28-熊果酸(2α，3-O-β-D-glucuronide-19α-dihydroxyurs-12-ene-28-oic acid，19)、3-β-O-α-L-阿拉伯糖-19α-羥基熊果烷-12 烯-28-酸-β-D-葡 萄 糖 酯 (3-β-O-α-L-arabinopyranosyl-19αhydroxy-urs-12-ene-28-β-D-glucopyranoside oic acid，20)、2β，3β，19α-三羥基熊果酸(2β，3β，19α-trihydroxy-12-ene-28-ursolic acid，21)、熊果酸 (ursolic acid，22)、2α，3β，19，23-四羥基-12 烯-28-熊果酸(myrianthic acid，23)、坡模酸(pomolic acid，24)、2α，19α-二羥基熊果酸(2α，19α-dihydroxy-12-ene-28-ursolic acid，25)、2β-羥基熊果酸 (2α-hydroxy-12-ene-28-ursolic acid，26)、3-O-β-D-葡萄糖-α-香樹脂醇苷(α-amyrin-3-O-β-D-glucopyranoside，27)、α-香樹脂醇(α-amyrin，28)、2α，3α-二羥基熊果酸(2α，3α-dihydroxy-12-ene-28-ursolic acid，29)、2α，19α-二羥基熊果酸 (2α，19α-dihydroxy-12-ene-28-ursolic acid，30)、2α，3β，19，24-四羥基-12-烯-28-熊果酸(2α，3β，19，24-tetrahydroxy-12-ene-28-oic acid，31)、2α-O-乙酰熊果酸(2α-O-acetyl ursolic acid，32)。

4 三萜類成分體外抗肝損傷活性研究

對上述分離得到的齊墩果烷型及熊果烷型五環(huán)三萜成分，采用葡萄糖氧化酶GO體外致肝損傷模型進行保肝作用觀察。

根據(jù)32個藥物的溶解性，選用相應(yīng)的溶劑，制備成1000 μg/mL的母液，實驗時，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液稀釋成濃度為 1、10、50、100 μg/mL 的溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。取凍存的L02細(xì)胞于37℃水浴鍋中快速搖溶，在超凈工作臺中，移入離心管中，并加入新鮮含10%胎牛血清的RPMI-1640，吹打成細(xì)胞懸液，1000 rpm離心3 min，棄上清，細(xì)胞沉淀加入新鮮含10%胎牛血清的RPMI-1640，吹打成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，放于5%CO2、濕度95%、37℃條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞達培養(yǎng)瓶底面積分?jǐn)?shù)80% ～90%融合后用PBS洗滌1次，加入0.25%的胰酶適度消化，再加入含10%胎牛血清培養(yǎng)基終止消化，吹打成細(xì)胞懸液。1000 rpm離心3 min，棄上清，按1∶3比例傳代。正常細(xì)胞對照組、正常細(xì)胞模型組、0.1%生理鹽水溶劑對照組、0.1%生理鹽水溶劑模型組、0.1%DMSO溶劑對照組、0.1%DMSO溶劑模型組、32個藥物組。每組設(shè)6個復(fù)孔。培養(yǎng)好的L02細(xì)胞，用0.25%的胰酶適度消化，用新鮮含10%胎牛血清的RPMI-1640吹打成單個細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL，接種到96孔培養(yǎng)板中，放置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h之后，吸出舊培養(yǎng)液，加入不含胎牛血清的 RPMI-1640，進行同步化。24 h之后加入相應(yīng)的各組含藥培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后，模型組及藥物組加入葡萄糖氧化酶GO(終濃度為100 mU/mL)造成氧化應(yīng)激模型。于GO作用4 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入 DMSO 150 μL，振蕩10min，溶解結(jié)晶物，在酶標(biāo)儀上490 nm處測定各孔的吸光值(A)。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件處理，顯著性檢驗采用t檢驗，P＜0.05時為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與正常細(xì)胞對照組比較，0.1生理鹽水溶劑對照組及0.1 DMSO溶劑對照組的吸光值沒有差異。與對照組比較，相應(yīng)的模型組的吸光值均顯著降低(P＜0.01)。與0.1%生理鹽水溶劑模型組比較，Urosanetype三萜較Oleane-type三萜的保肝活性明顯增強，多羥基取代都使得化合物的保肝活性顯著升高。

圖1 齊墩果烷母核Fig.1 Chemical structures of Oleane-type triterpenoids

表1 齊墩果烷型三萜類化合物Table 1 Structure，experimental and calculated activity values of Oleane-type triterpenoids

5 OH OH CH2OH CH3 OH CH3 COOH H 1.258 0.099 0.239 -0.140 6 OH OH CH3 CH2OH H CH2OH COOH H 2.365 0.374 0.341 0.033 7 H OH CH2OH CH3 H CH3 COOH H 35.522 1.550 1.646 -0.096 8 H OCOCH3 CH3 CH3 H CH3 COOH H 64.35 1.808 1.798 0.010 9 OH OH CH3 CH2OH OH CH3 COOGlu OH 56.332 1.751 1.675 0.076 10 H O-Glu CH3 CH3 H CH3H H ＞100 2.000 1.992 0.088

圖2 熊果烷母核Fig.2 Chemical structures of Urosane-type triterpenoids

表2 熊果烷型三萜類化合物結(jié)構(gòu)、活性數(shù)據(jù)及預(yù)測結(jié)果Table 2 Structure，experimental and calculated activity values of Urosane-type triterpenoids

5 三萜類成分三維定量構(gòu)效關(guān)系的研究

本文采用Tripos公司的SYBYL 1.3分子模擬軟件包完成所有分子模型構(gòu)建和統(tǒng)計分析工作。如無特殊說明，所選參數(shù)均為默認(rèn)值。本文研究的32個三萜類化合物的保肝活性數(shù)據(jù)(IC50)來源于體外保肝實驗，見表1，活性數(shù)據(jù)形式經(jīng)過負(fù)對數(shù)變換(pIC50=-lgIC50)，這種變換不影響模型的內(nèi)在規(guī)律。隨機選擇4個化合物作為測試集，用來檢驗?zāi)Ｐ偷念A(yù)測能力，其余化合物為訓(xùn)練集。

第一步，活性構(gòu)象確定。由于CoMFA研究涉及到化合物分子的三維結(jié)構(gòu)，因此確定活性構(gòu)象是CoMFA研究的關(guān)鍵步驟。先用sybyl x1.3軟件中sketch molecule構(gòu)建化合物，然后以分子力學(xué)程序Minimize進行能量優(yōu)化，優(yōu)化過程中采用Powell能量梯度法、Tripos力場、Gasteiger-Hckel電荷，迭代1000次，能量收斂限定為0.005 kj/mol，得到優(yōu)化分子結(jié)構(gòu)，建立分子庫。

第二步，分子疊合。是CoMFA方法中的關(guān)鍵一步，對于所建立的三維構(gòu)效關(guān)系模型質(zhì)量有重要影響。當(dāng)活性構(gòu)象確定后，一般根據(jù)一定的規(guī)則，如藥效團、力場、公共骨架等進行分子疊合，使每個分子采用具有最大力場相似性的空間取向進行計算。本研究選擇活性最好的化合物31為模板分子，用A-lign Database進行骨架疊合，見圖3。

第三步，CoMFA模型的構(gòu)建。將重疊好的分子置于自動生成的三維網(wǎng)格中，網(wǎng)格包含所有分子，并且在 X、Y、Z軸方向至少延伸0.4 nm。用一個sp3雜化的正碳原子探測每個格點上的立體場與靜電場能，利用偏最小二乘法(PLS)建立模型，首先用SAMPLS方法做LOO(Leave-one-out)交叉驗證，得到最佳主成分?jǐn)?shù)和交叉驗證系數(shù)q2。然后在最佳主成分?jǐn)?shù)下做非交叉驗證，建立相應(yīng)的CoMFA模型。隨后，采用SteDev* Coeff方法顯示三維等值圖，直觀地反映出立體場和靜電場對活性的影響。

圖3 化合物的分子疊合圖Fig.3 Superimposition map of compounds

6 結(jié)果與討論

本文以28個化合物為訓(xùn)練集，在自動生成的網(wǎng)格上，以sp3雜化的正碳原子為探針，計算分子在每個格點上的立體場和靜電場(相應(yīng)的立體作用能與靜電作用能的閾值均用默認(rèn)值)，交叉驗證相關(guān)系數(shù)q2為0.719，最佳主成分?jǐn)?shù)為6;由最佳主成分?jǐn)?shù)進行非交叉驗證得到常規(guī)相關(guān)系數(shù)γ2為0.976;標(biāo)準(zhǔn)方差(SEE)為0.124，數(shù)據(jù)組之間的平均平方誤差與數(shù)據(jù)組內(nèi)部的平均平方誤差的比值(F)為142.001，立體場和靜電場的貢獻值分別為86.7%%和13.3%，表明空間效應(yīng)是主要的影響因素。一般認(rèn)為，q2大于0.5時，所得模型具有可信的預(yù)報能力，非交叉驗證的常規(guī)相關(guān)系數(shù)大于0.9時，表明模型有很好的自身一致性。本模型 q2達到0.719，γ2達到0.976，說明該模型具有較好的預(yù)測能力和自身一致性。由CoMFA模型預(yù)測的各化合物活性及其與實驗值的殘差見表1。預(yù)測值與實驗值的相關(guān)分析圖見圖4。

圖4 CoMFA模型預(yù)測活性與實驗活性之間的關(guān)系Fig.4 Predicted and experimental pIC50for the CoMFA model

圖5為較為理想的CoMFA模型三維等值圖，從疊合分子周圍空間可看出化合物的各種不同場對活性的影響。立體場分布圖(5A)中，在綠色區(qū)域引入大體積取代基或在黃色區(qū)域減小取代基的體積有利于化合物活性的提高，靜電場分布圖(5B)中，在藍色區(qū)域引入正電性基團或在其紅色區(qū)域引入負(fù)點性較大的基團將有利于化合物活性增加，分析可得Urosane-type三萜較Oleane-type三萜的保肝活性明顯增強;在3、19、20、23和24等5個取代位置添加帶負(fù)電荷的基團如-OH，則使化合物的保肝活性明顯提高;如在這些位置引入疏水性較強的基團如-CH3等，則可能使化合物的保肝活性降低。在19和23兩個位置上接入-OH化合物比其他位置接上-OH的化合物保肝活性明顯要好。該結(jié)論同藥理活性實驗結(jié)果一致，進一步說明本文所建立的CoMFA模型具有較好的預(yù)測能力。

綜上所述，本文對32個五環(huán)三萜類化合物進行的3D-QSAR研究，構(gòu)建了一個預(yù)測能力較強的CoMFA模型，其交叉驗證系數(shù)q2為0.719，非交叉驗證系數(shù)γ2為0.976，統(tǒng)計方差比F=142.001，影響藥效立體場的靜電場貢獻分別為86.7%%和13.3%，表明空間效應(yīng)是主要的影響因素。以上研究結(jié)果說明Urosane-type三萜可以作為保肝藥的候選先導(dǎo)化合物，為后續(xù)深入進行具有針對性的局部結(jié)構(gòu)改造和優(yōu)化提供較為理想的模板，有望開發(fā)出具有更高保肝活性的化合物。

圖5 CoMFA模型等值圖Fig.5 Contour maps of the CoMFA model

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