人心肌干細胞的體外改良培養(yǎng)*

胡圣大, 馬根山, 姚玉宇, 陳中璞, 嚴鳳娣

(東南大學附屬中大醫(yī)院心內(nèi)科, 江蘇 南京 210009)

·實驗技術·

人心肌干細胞的體外改良培養(yǎng)*

胡圣大, 馬根山△, 姚玉宇, 陳中璞, 嚴鳳娣

(東南大學附屬中大醫(yī)院心內(nèi)科, 江蘇 南京 210009)

目的用改良的培養(yǎng)基培養(yǎng)人心肌干細胞，并篩選鑒定。方法通過心臟外科手術取下右心耳組織，用組織塊培養(yǎng)法來獲得原代心肌干細胞，用改良的心肌干細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，增殖傳代后進行心肌干細胞表面標志物的鑒定，再用免疫磁珠篩選以獲得較純的目的心肌干細胞。結(jié)果培養(yǎng)約2周后，貼壁良好的心肌組織塊周圍可見有小、圓、亮的細胞爬出，用Accutase(細胞消化液)短時間消化后沖洗細胞，培養(yǎng)增殖傳代，其增殖能力與傳統(tǒng)心肌干細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞比較無顯著差異，用流式細胞術鑒定c-Kit(干細胞表面標志物)，其陽性率(6.8±2.1)%，之后用含抗c-Kit抗體(anti-c-Kit)的磁珠進行分選，即得較純的c-Kit陽性(c-Kit+)心肌干細胞,它們可以分化為心肌細胞。結(jié)論通過心臟組織塊貼壁培養(yǎng)法，用改良后的心肌干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，再借助免疫磁珠的分選，同樣可得到較純的c-Kit+心肌干細胞。

心肌干細胞； 流式細胞術； 磁珠分選

一直以來的傳統(tǒng)觀念都認為哺乳動物的心臟是終末分化器官，心肌細胞是永久性細胞(正常情況下心肌細胞的壽命與個體壽命相同，不能分裂增殖)。伴隨著疾病和衰老，部分成年心肌細胞丟失，只能通過剩余心肌細胞的肥大和結(jié)締組織的增生纖維化來進行重構代償。然而，近年來這一觀點正逐漸被動搖，認為成年心臟雖是終末器官，但心肌組織中含有可以再生的細胞，稱之為心肌干細胞，它可以分化為心肌細胞、內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞[1]。在人的一生中，成年心肌細胞不停地衰老死亡，同時由心肌干細胞不斷增殖分化為新的心肌細胞，維持心肌細胞數(shù)目的動態(tài)平衡，保持心臟功能[2-3]。

病理情況下心肌細胞的丟失量超過其增殖代償能力，便會出現(xiàn)前述傳統(tǒng)觀念的變化，因此如何進一步促進心肌干細胞的增殖歸巢分化便成為當前研究的熱點。而這些研究的基礎在于心肌干細胞的培養(yǎng)獲得，本研究旨在探索一條簡便實用的培養(yǎng)方法，為心肌干細胞的進一步研究打下基礎。

材 料 和 方 法

1材料

Trypsin和collagenaseⅣ粉劑購自Biosharp;Accutase購自Millipore;無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、胎牛血清、L-谷氨酰胺、青霉素鏈霉素雙抗、IMDM和DMEM/F12培養(yǎng)液均購自HyClone;β-巰基乙醇購自Sunshine;血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)購自Sigma;anti-c-Kit microbeads和anti-c-Kit-PE購自Miltenyi Biotec；恒溫細胞培養(yǎng)箱購自Thermo；恒溫振蕩儀購自太倉市科教器材廠。

2方法

2.1取材和培養(yǎng) 心臟外科手術過程中(患者年齡2～72歲；心臟疾病有：冠心病、瓣膜病和先心病)，在情況許可的條件下，取右心耳組織數(shù)克。用不含鈣、鎂的無菌PBS沖洗掉血液，去掉脂肪組織后剪成大小1 mm×1 mm ×1 mm 左右的小塊，然后移入離心管加入適量0.2%胰蛋白酶和0.1%膠原酶IV的混合液，37 ℃振蕩消化5 min，移去消化液，重復3次。處理后的組織塊用完全組織塊培養(yǎng)液(complete explant medium，CEM;以IMDM為基礎，含20%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和0.1 mmol/L β-巰基乙醇)沖洗1～2次后移入到6孔板中并使其均勻分散。加入少量CEM(約0.5 mL左右)，保持組織塊濕潤即可，置于37 ℃、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中貼壁。8～12 h后加入1～1.5 mL的CEM，繼續(xù)前述條件培養(yǎng)，2～3 d換1次培養(yǎng)液。

2.2心肌干細胞的收集培養(yǎng) 通常3～7 d的時間內(nèi)，貼壁良好的心肌組織塊周圍可見到先有長梭形的成纖維細胞爬出，之后數(shù)天即可見在其上面爬出的小、圓、亮的細胞，當有較多的此類細胞時，即用Accutase消化(約2 min即可)，之后加入少量改良的心肌干細胞培養(yǎng)液(improved cardiosphere-growing medium，improved CGM;以DMEM/F12為基礎,含10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和0.1 mmol/L β-巰基乙醇，較之傳統(tǒng)的CGM，減少了VEGF和bFGF 2種細胞因子)，輕柔地沖洗數(shù)次，將沖洗后的混合液移入6 cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，置于37 ℃、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)傳代增殖，2～3 d換1次培養(yǎng)液。

2.3心肌干細胞的鑒定及純化 待3～6 d后，培養(yǎng)皿中的細胞基本上生長融合，且為單層細胞，用Accutase消化3～5 min，取適量樣品，加入anti-c-Kit-PE孵育后行流式細胞術分析，剩余細胞用anti-c-Kit抗體吸附的磁珠進行分選[4-5]，即可得到較多較純的c-Kit+心肌干細胞。

2.4心肌干細胞的增殖和分化測定 利用CCK-8(Cell Counting Kit-8)來測定細胞增殖能力，細胞接種于96孔板，每孔約3×103細胞，分別用傳統(tǒng)的CGM和不含VEGF和bFGF的CGM進行培養(yǎng)，3 d后各16個孔在450 nm處測定A值，所得數(shù)據(jù)間接表示細胞的量，所有步驟嚴格按試劑盒說明進行。開胸結(jié)扎前降支制作裸鼠心梗模型后，經(jīng)心外膜注射心肌干細胞，4周后取心肌組織進行組織免疫熒光染色鑒定心肌干細胞的分化情況。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗。

結(jié) 果

1組織塊的培養(yǎng)

貼壁好的組織塊周圍，早的3 d后即可看見周圍有梭形的成纖維細胞爬出，最晚的1周左右也可以爬出，否則通常不再會有細胞爬出。成纖維細胞爬出后3 d左右在其上面即可以出現(xiàn)小、圓、亮的細胞，以后逐漸增多,見圖1。

Figure 1. Primary cardiac stem cells cultured from tissue blocks (×100). Lower left corner: myocardial tissue blocks.The arrows show small, round and bright primary cardiac stem cells,while the triangles refer to the fibroblasts.

圖1組織塊培養(yǎng)的原代心肌干細胞

2心肌干細胞的獲得、培養(yǎng)及純化鑒定

待小、圓、亮的細胞出現(xiàn)較多后即可消化沖洗下來移入培養(yǎng)皿培養(yǎng)增殖，此時部分心肌干細胞貼壁后空間不受約束，胞質(zhì)會向外伸展而形成梭形、多邊形或不規(guī)則異形等形狀,見圖2。不同年齡及疾病患者細胞的c-Kit陽性率是不一樣的，總體上未分選細胞c-Kit的陽性率約2%～18%(6.8%±2.1%),見圖3。經(jīng)磁珠分選后即可得到一定量的較純的c-Kit+心肌干細胞，c-Kit陽性率可超過80%。所得細胞可于-80 ℃較長時間保存(更長時間保存應保存于液氮中)，且復蘇后仍具有干細胞活力。

3心肌干細胞的增殖和分化

利用CCK-8法我們測定了細胞的增殖能力，均直接用A值表示細胞的量，傳統(tǒng)CGM培養(yǎng)組和不含VEGF及bFGF的CGM組A值分別是0.156±0.013和0.149±0.011，兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。體內(nèi)心肌干細胞的分化實驗明確其可以分化為心肌細胞,見圖4。

Figure 2. The second generation of cardiac stem cells (×200).

圖2傳至第2代的呈球形的心肌干細胞

Figure 3. Flow cytometric identification of cardiac stem cells.A: control; B: labeled with anti-c-Kit-PE flow cytometry antibody and the c-Kit positive rate was 8.44%.

圖3消化下的第2代心肌干細胞的流式細胞術鑒定

Figure 4. Identification of the differentiation of cardiac stem cells using tissue immunofluorescence technique (×200). Red fluorescence shows staining of myocyte cytoplasm by sarcomeric α-actin antibody; blue fluorescence shows nuclei; green fluorescence shows localization of mitochondria.

圖4心肌干細胞的分化鑒定

討 論

常用于鑒定心肌干細胞的表面標記有c-Kit、isl1和Sca-1等[6-8]，本實驗室測得Sca-1陽性的細胞數(shù)比例僅1.4%(由于市面上暫無用于測人干細胞的Sca-1，考慮到可能的交叉反應，遂試用抗小鼠的anti-Sca-1，同時測得小鼠心肌干細胞的Sca-1陽性率1.8%，較之人無顯著差異)。而用anti-isl1則幾乎無陽性表達，加之文獻報道認為從人心肌組織中分離的c-Kit+細胞即為心肌干細胞[6]，故我們實驗室最終確定選定c-Kit為心肌干細胞的待測表面標志。

本研究采用Messina等[9]的組織塊培養(yǎng)法獲取原代細胞，該方法避免了長時間多次酶消化對細胞造成的損傷，在大大減少了雜細胞的同時也最大限度地使用了心肌組織塊，可以反復多次地從組織塊周圍消化下所需的細胞。對于小、圓、亮的細胞采用Accutase短時間消化后用改良的CGM輕柔沖洗2～3次，用力較大則會將組織塊沖下，其獲取細胞的效率比Tang等[10]報道的D-Hanks液沖洗法要高很多，而且Accutase作用較溫和，對所得細胞的活性及表面標志影響均不大，c-Kit的陽性率與國外文獻報道的一致[1]。本實驗室前期的細胞培養(yǎng)液CGM中均加入了EGF和bFGF，在本研究的細胞培養(yǎng)中，我們嘗試著使用未加EGF和bFGF的改良CGM，發(fā)現(xiàn)細胞的增殖活力在通常情況下并沒有發(fā)生明顯的改變，用于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)皿3～6 d即需傳代分瓶，之后的流式細胞術分析鑒定c-Kit的陽性率沒有明顯的差異[1]。

實驗中還有幾個關鍵點：首先是組織塊的初次加液量與貼壁時間的掌握，時間短加液過多均導致組織塊未貼壁好，細胞無法爬出，時間久加液少，培養(yǎng)液干涸組織塊細胞死亡；其次是初次消化細胞時間的掌握，過短細胞消化不下來，過久會消化下貼壁較牢的成纖維細胞，致使雜細胞過多，為后續(xù)的實驗增加工作量，甚至影響心肌干細胞的增殖分化。由于所得原代細胞數(shù)量較少(若是單用D-Hanks沖洗，所得細胞數(shù)量更少)，若直接用磁珠分選細胞，首先會浪費磁柱的利用率；其次加之操作過程中丟失及破壞的細胞，最后所得目的細胞已所剩無幾。故而本實驗室在取得原代細胞后，先經(jīng)3～6 d的增殖后再進行磁珠分選，得到目的細胞的數(shù)量大大增加。

總之，本實驗室采用組織塊貼壁培養(yǎng)法，成功地獲得原代心肌干細胞后，未加EGF和bFGF的改良細胞培養(yǎng)液也成功地運用于心肌干細胞的培養(yǎng)，這種改良的細胞培養(yǎng)液對干細胞的增殖分化能力及c-Kit的表達未產(chǎn)生明顯的影響，但卻大大減少了細胞培養(yǎng)的實驗費用。培養(yǎng)獲得的心肌干細胞可用于進一步的研究，以期最終能夠解決臨床問題。

(致謝:感謝東南大學附屬中大醫(yī)院心胸外科劉志勇教授和何偉博士提供的人心肌組織塊！)

[1] Bearzi C, Rota M, Hosoda T, et al. Human cardiac stem cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(35):14068-14073.

[2] Bergmann O, Bhardwaj RD, Bernard S, et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans[J]. Science, 2009, 324(5923):98-102.

[3] Beltrami AP, Barlucchi L, Torella D, et al. Adult cardiac Stem cells are multipotent and support myocardial regeneration[J]. Cell, 2003, 114(6): 763-776.

[4] 何勁松，陳積圣，閔 軍，等. 免疫磁性細胞系統(tǒng)分離篩選和熒光標記骨髓干細胞亞群Thy-1lowLin-Sca-1+的研究[J]. 中國病理生理雜志, 2004, 20(8):1497-1498，1521.

[5] 鄭偉紅, 萬亞峰, 馬小鵬，等. 從PBMCs及CD133免疫磁珠分選獲得內(nèi)皮祖細胞的體外研究[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(2):379-383.

[6] Dawn B, Stein AB, Urbanek K, et al. Cardiac stem cells delivered intravascularly traverse the vessel barrier, regenerate infarcted myocardium, and improve cardiac function[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(10):3766-3771.

[7] Laugwitz KL, Moretti A, Lam J, et al. Postnatal isl1+cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages[J]. Nature, 2005, 433(7026):647-653.

[8] Wang XH, Hu QS, Nakamura Y, et al. The role of the Sca-1+/CD31-cardiac progenitor cell population in postinfarction left ventricular remodeling[J]. Stem Cells, 2006, 24(7):1779-1788.

[9] Messina E, Angelis LD, Frati G, et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart[J]. Circ Res, 2004, 95(9):911-921.

[10]Tang YL，Shen L，Qian K，et al．A novel two-step procedure to expand cardiac Sca-1+cells clonally[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 359(4):877-883．

Cultureofhumancardiacstemcellswithimprovedcardiosphere-growingmediuminvitro

HU Sheng-da, MA Gen-shan, YAO Yu-yu, CHEN Zhong-pu, YAN Feng-di

(DepartmentofCardiology,theAffiliatedZhongdaHospitalofSoutheastUniversity,Nanjing210009,China.E-mail:magenshan@hotmail.com)

AIM: To prepare an improved medium for culturing human cardiac stem cells.METHODSThe heart samples of the right auricle obtained from the patients after cardiac surgery were minced into pieces (about 1 mm×1 mm×1 mm), digested and cultured. The primary cells obtained were cultured with improved cardiosphere-growing medium (CGM) for proliferation, and the cells were identified by flow cytometry. Finally, purer c-kit+cells were obtained by the method of magnetic bead sorting.RESULTSAfter about 2 weeks of culture, small, round and phase-bright cells migrated from the well-adherent explants over a layer of fibroblast-like cells. These cells were collected by a brief digestion with Accutase, washed and cultured with improved CGM. No significant difference of the proliferative capacity between using traditional CGM and improved CGM was observed. After subculture and proliferation, the identification result by flow cytometry showed that the positive rate of c-Kit surface marker on these cells was (6.8±2.1)%. By the method of anti-c-Kit magnetic bead sorting, purer c-Kit+cardiac stem cells were obtained and differentiated into cardiomyocytes.CONCLUSIONPurer c-Kit+cardiac stem cells are isolated with the improved CGM culture.

Cardiac stem cells; Flow cytometry; Magnetic bead sorting

R542.2+2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.02.035

1000- 4718(2013)02- 0381- 04

2012-07-03

2012-12-27

國家自然科學基金資助項目(No.6590000029)

△通訊作者Tel： 025-83272038； E-mail: magenshan@hotmail.com