甘油和半纖維素水解液共發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇

金 平，王領(lǐng)民，張 霖，廖 莎，黃 和

（1. 中國石化 撫順石油化工研究院，遼寧 撫順 113001；2. 南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210009）

當(dāng)前生物煉制技術(shù)的快速發(fā)展引起人們的廣泛關(guān)注，它是以一種可持續(xù)發(fā)展的方式解決石油資源匱乏和環(huán)境污染問題［1］。以可再生資源為原料，采用生物煉制技術(shù)生產(chǎn)大宗化工產(chǎn)品，實現(xiàn)石油基化工產(chǎn)品的生物替代有著重大的現(xiàn)實意義。1，3-丙二醇（1，3-PDO）是用于合成聚酯和聚氨酯的重要單體，目前市場需求量巨大［2］。與化學(xué)法相比，甘油發(fā)酵法生產(chǎn)1，3-PDO以其環(huán)境友好和節(jié)能減排等諸多優(yōu)點展示出良好的發(fā)展前景。在甘油發(fā)酵工藝中，甘油原料價格對1，3-PDO生產(chǎn)成本有較大影響，因此利用廉價碳源作為發(fā)酵輔助碳源，降低甘油消耗，促進(jìn)1，3-PDO的生物合成成為研究熱點［3］。

半纖維素是自然界中常見的多糖，在木質(zhì)生物質(zhì)中占20%～35%（w）。近年來，由于木質(zhì)纖維素廣泛用于各種農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的生產(chǎn)過程，人們也開始關(guān)注半纖維素水解液（HH）的生物轉(zhuǎn)化［4］。利用稀硫酸預(yù)處理玉米秸稈是一種常見且較有效的方法。但酸解過程會產(chǎn)生很多單糖和微生物抑制物，主要包括木糖、葡萄糖、甘露糖、醋酸和糠醛等。目前雖然有大量關(guān)于HH生物利用制取乙醇的研究，但很少有研究關(guān)注HH中各種還原糖分和各種抑制物對以K. pneumoniae為菌種生產(chǎn)1，3-PDO的影響［5］。

本工作以K.pneumoniae為菌種，利用HH作為輔助底物與甘油共發(fā)酵，考察了HH對細(xì)胞生長和1，3-PDO合成的影響。

1 實驗方法

1.1 菌種

菌種采用K.pneumoniae（FY-5），為中國石化撫順石油化工研究院自主篩選，4 ℃下保存于Luria-Bertani培養(yǎng)基斜面。

1.2 玉米秸稈酸解處理

將玉米秸稈研磨為粒徑小于等于1 mm的粉末。以液固質(zhì)量比10∶1向粉末中加入2%（φ）的H2SO4溶液，在100 ℃下處理2 h。然后在25 ℃下用Ca（OH）2調(diào)節(jié)水解液pH至8.0，所得上清液即HH（成分見表1）。將上清液在40 ℃下真空蒸發(fā)濃縮至木糖質(zhì)量濃度達(dá)到50 g/L，作為補料分批發(fā)酵的原料［6-7］。

表1 HH的成分Table 1 Composition of hemicellulose hydrolysate(HH)

1.3 菌種的培養(yǎng)和發(fā)酵

種子培養(yǎng)基組成為：酵母粉3.0 g/L、麥芽粉3.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L和NaCl 5.0 g/L?；景l(fā)酵培養(yǎng)基組成為：酵母粉5.0 g/L、K2HPO4·3H2O 10.0 g/L、KH2PO42.0 g/L、NH4Cl 1.0 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L、FeCl3·6H2O 30 mg/L、CoCl2·6H2O 5 mg/L、維生素B125 mg/L和甘油30.0 g/L。共發(fā)酵培養(yǎng)基在基本發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上補充了HH。HH中含有木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖，其中木糖為主要碳源；還含有3種主要抑制物：糠醛、甲酸鹽和乙酸鹽（見表1）。實驗過程中向基本發(fā)酵培養(yǎng)基中分別單獨添加一定濃度的4種單糖（葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖）的一種、組合添加單糖以及單獨添加3種抑制物的一種，來檢測它們對細(xì)胞生長和1，3-PDO合成的影響。

在含有100 mL種子培養(yǎng)基的搖瓶（250 mL）中接種K. pneumoniae，于37 ℃、140 r/min下在搖床中培養(yǎng)10 h。然后以5%（φ）的接種量接入含有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶（250 mL）中。在3 L攪拌罐中進(jìn)行批次發(fā)酵，培養(yǎng)基為基本發(fā)酵培養(yǎng)基或共發(fā)酵培養(yǎng)基，工作體積為2 L，通氣量為0.25 m3/（m3·min）。初始pH為7.0，發(fā)酵過程中不控制pH，發(fā)酵溫度37 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min。

在7 L攪拌罐中進(jìn)行補料分批發(fā)酵，工作體積為4 L，通氣量為0.25 m3/（m3·min）。在甘油和HH共發(fā)酵過程中，添加HH（2 L）使初始木糖質(zhì)量濃度為11.20 g/L，發(fā)酵過程中木糖質(zhì)量濃度控制在5～8 g/L；甘油初始質(zhì)量濃度為30 g/L，發(fā)酵過程中甘油質(zhì)量濃度控制在15～20 g/L。通過控制HH流加速率在線調(diào)節(jié)發(fā)酵體系中組分的濃度，采用10 mol/L的NaOH 溶液自動調(diào)節(jié)pH為7.0。

1.4 分析方法

利用Yan等［8］報道的方法檢測HH的成分。采用Dionex公司UltiMate 3000型高效液相色譜儀。甲酸和乙酸用Bio-Rad Aminex HPX-87H柱檢測，示差檢測器，流動相為0.005 mol/L的H2SO4溶液，流量0.6 mL/min，柱溫60 ℃；糖用Bio-RAD Aminex HPX-87P柱檢測，示差檢測器，流動相為水，流量0.6 mL/min，柱溫85 ℃；甘油、1，3-PDO、2，3-丁二醇（2，3-BDO）、乳酸、乙醇、琥珀酸和木糖用Bio-Rad Aminex HPX-87H柱檢測，示差檢測器，流動相為0.005 mol/L的H2SO4溶液，流量0.8 mL/min，柱溫65 ℃。

生物量的測定采用世諾公司752型紫外-可見分光光度計。通過測定菌體在600 nm處的吸光度（OD600），再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程（見式（1））將OD600轉(zhuǎn)化成細(xì)胞干重（CDW）。

課外科技活動不僅僅是第二課堂，它還包括多種形式的實踐活動，主要目的是培養(yǎng)學(xué)生的科技意識、實踐動手能力、團(tuán)隊協(xié)作能力以及創(chuàng)新創(chuàng)造能力，使學(xué)生的知識、技能與不斷發(fā)展的社會要求相適應(yīng)，真正將應(yīng)用型本科教育發(fā)展與滿足社會需求相融合。其主要形式包括學(xué)術(shù)講座、各類科技競賽、專利發(fā)明創(chuàng)造、科學(xué)研究(撰寫論文、參與或申請課題等)、創(chuàng)業(yè)大賽、模擬情境或真實情境的科技活動、帶有專業(yè)色彩的系列校園文化活動等[2]。

2 結(jié)果與討論

2.1 以HH為輔助底物批次發(fā)酵生產(chǎn)1，3-PDO

以HH為輔助底物在3 L攪拌罐中批次發(fā)酵與甘油單獨發(fā)酵的比較見表2。

表2 以HH為輔助底物在3 L發(fā)酵罐中批次發(fā)酵與甘油單獨發(fā)酵的比較Table 2 Comparison between batch fermentation with HH as cosubstrate in a 3 L reactor and fermention with AG as alone substrate

由表2可看出，通過添加HH，發(fā)酵效率明顯提高。發(fā)酵20 h后，1，3-PDO的質(zhì)量濃度、甘油的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)力比甘油單獨發(fā)酵分別提高了18.2%，24.4%，18.0%。共發(fā)酵的副產(chǎn)物，除乙酸外，2，3-BDO、乙醇、琥珀酸和乳酸的質(zhì)量濃度也有不同程度的提高，特別是2，3-BDO的質(zhì)量濃度是甘油單獨發(fā)酵的2倍以上。菌體生物量（以O(shè)D600計）也從5.48提高到7.13。

盡管前期研究［9-10］已采用甘油和木糖共發(fā)酵，但由于采用純木糖作為輔助底物，仍存在高成本問題。上述實驗結(jié)果表明，添加HH是一種用于提高1，3-PDO發(fā)酵效率的經(jīng)濟(jì)可行的方法。HH雖不能直接轉(zhuǎn)化成1，3-PDO，但可用于生物量的積累和還原力的再生，進(jìn)而使更多的甘油和還原力流向1，3-PDO的合成途徑。

早期的研究［11］表明，生物量和1，3-PDO的生物合成呈正相關(guān)，即生物量越大，生產(chǎn)力越高。本實驗得到類似的結(jié)果，但2，3-BDO的生成量偏大，原因可能如下：1）2，3-BDO適宜的發(fā)酵pH為6.5，尤其適合沒有pH控制的條件［8-9］；而本實驗批次發(fā)酵過程中不進(jìn)行pH控制，由于副產(chǎn)物酸的生成，使體系大部分時間都處于低pH；2）更多的底物（甘油和HH）和提供H的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸流向2，3-BDO的合成途徑；3）在HH中木糖含量最大，K. pneumoniae菌種可直接利用木糖和葡萄糖發(fā)酵合成2，3-BDO。

2.2 HH中各種糖組分對細(xì)胞生長和1，3-PDO合成的影響

在一定濃度下，HH中的各種糖組分對細(xì)胞生長和1，3-PDO合成的影響見圖1。

圖1 HH中的各種糖組分對細(xì)胞生長和1，3-PDO合成的影響Fig.1 Effects of every sugars in HH on the cell growth and 1，3-PDO biosynthesis.

由圖1可看出，在搖瓶中發(fā)酵29 h后，以木糖（11.20 g/L）為輔助底物共發(fā)酵，1，3-PDO的質(zhì)量濃度（10.35 g/L）和生物量（OD600=4.17）均達(dá)到最大。添加甘露糖（0.65 g/L）也能顯著提高1，3-PDO的質(zhì)量濃度（9.79 g/L）和生物量（OD600=3.90）。這可能是由于在K. pneumoniae菌種中，甘露糖的代謝可以更有效地積累還原力。因此，盡管在HH中甘露糖的含量很低，但對細(xì)胞生長和1，3-PDO合成有較顯著的影響。半乳糖（1.03 g/L）和阿拉伯糖（1.72 g/L）對細(xì)胞生長和1，3-PDO合成沒有影響。與甘油單獨發(fā)酵相比，葡萄糖（1.45 g/L）對1，3-PDO合成產(chǎn)生負(fù)面影響：生物量提高了6.5%，而1，3-PDO的質(zhì)量濃度下降了20.5%。葡萄糖抑制了1，3-PDO的合成可能是由于“葡萄糖效應(yīng)”造成的，細(xì)菌培養(yǎng)過程中在葡萄糖沒有被利用完之前，甘油不能被利用［12］。

利用混合糖模擬HH（其中含有葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、乳糖和木糖，其質(zhì)量濃度分別控制在1.45，0.65，1.72，1.03，11.20 g/L），研究各種糖的組合對批次發(fā)酵的影響，實驗結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 混合糖對細(xì)胞生長和1，3-PDO合成的影響Fig.2 Effects of mixed sugars(MS) on the cell growth and 1，3-PDO biosynthesis.

圖3 混合糖中各組分在1，3-PDO合成中的消耗情況Fig.3 Consumption of the every components in the MS in 1，3-PDO biosynthesis.

由圖3可看出，與甘油單獨發(fā)酵相比，添加混合糖發(fā)酵時，甘油吸收速率在前4 h相對較低；4～8 h超過甘油單獨發(fā)酵過程，此時1，3-PDO快速積累。發(fā)酵過程中木糖、葡萄糖和甘露糖同時以一定的速率消耗，半乳糖和阿拉伯糖在整個發(fā)酵過程中濃度基本不變化，表明K. pneumoniae菌種不能利用半乳糖和阿拉伯糖發(fā)酵合成1，3-PDO。

2.3 HH中主要抑制物對細(xì)胞生長和1，3-PDO合成的影響

HH中的主要抑制物有糠醛、甲酸鹽和乙酸鹽，這些抑制物對細(xì)胞生長和1，3-PDO合成的影響見圖4。由圖4可看出，與不添加抑制物相比，添加0.28 g/L糠醛時，生物量提高了12%，同時1，3-PDO質(zhì)量濃度也略有提高。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因一方面可能是低濃度糠醛不會對菌種生長產(chǎn)生抑制，另一方面可能是低濃度糠醛在代謝過程中被轉(zhuǎn)化成低抑制的物質(zhì)［13］。添加0.61 g/L甲酸鹽時，對細(xì)胞生長和1，3-PDO的合成產(chǎn)生輕微抑制，生物量和1，3-PDO質(zhì)量濃度分別降低了9.8%和1.1%。而添加1.46 g/L乙酸鹽時，生物量略有提高，1，3-PDO質(zhì)量濃度從8.77 g/L增至11.73 g/L。

圖4 HH中主要抑制物對細(xì)胞生長和1，3-PDO合成的影響Fig.4 Effects of main inhibitors in HH on the cell growth and 1，3-PDO biosynthesis.

關(guān)于高濃度乙酸鹽對發(fā)酵過程的影響有很多報道。Xue等［14］的研究表明，有機酸鹽（檸檬酸鹽、延胡索酸鹽和琥珀酸鹽）的添加可提高1，3-PDO的產(chǎn)量，乳酸和乙醇等副產(chǎn)物的產(chǎn)量會明顯降低；而添加10 g/L乙酸時會抑制1，3-PDO的生產(chǎn)。Lü等［15］研究了乙酸鹽對富含多糖的有機污水發(fā)酵過程的影響。他們發(fā)現(xiàn)在體系pH為6時添加一定量的乙酸鹽會產(chǎn)生乙醇，同時產(chǎn)生甲醇和甲酸鹽。He等［16］也報道了提高乙酸鹽的濃度對發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響，這種促進(jìn)作用使Thermonanaerobacter ethanolicus菌種發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量提高394%。同樣，利用乙酸鹽還可由Clostridium acetobutylicum菌種發(fā)酵生產(chǎn)丁醇和由Kelbsiella aerogenes菌種發(fā)酵生產(chǎn)丁二醇［17］。而本實驗結(jié)果表明，低濃度的乙酸鹽可有效促進(jìn)K.pneumoniae菌種發(fā)酵合成1，3-PDO。

2.4 以HH為輔助底物補料分批發(fā)酵生產(chǎn)1，3-PDO

以HH為輔助底物在7 L攪拌罐中補料分批發(fā)酵與甘油單獨發(fā)酵的比較見表3。

表3 以HH為輔助底物在7 L攪拌罐中補料分批發(fā)酵與甘油單獨發(fā)酵的比較Table 3 Comparison between fed-batch fermentation with HH as cosubstrate in a 7 L reactor and fermention with glycerol as alone substrate

由表3可看出，以HH為輔助底物進(jìn)行補料分批發(fā)酵，終點生物量（OD600）達(dá)到15.09，高于甘油單獨發(fā)酵的結(jié)果（10.45）。HH的添加提高了1，3-PDO的質(zhì)量濃度、甘油的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)力，使其分別從60.78 g/L提高到71.58 g/L、從52%提高到65%以及從1.64 g/（L·h）提高到1.93 g/（L·h），比甘油單獨發(fā)酵分別提高了17.8%，25.0%，17.7%。比較表2和表3可看出，相對于1，3-PDO，除2，3-BDO和乳酸鹽外，其他副產(chǎn)物的產(chǎn)出情況類似于批次發(fā)酵。由于pH控制在7.0不利于形成2，3-BDO，因此補料分批發(fā)酵2，3-BDO的產(chǎn)量比批次發(fā)酵低；而乳酸鹽適合在pH為7.0條件下形成，而且有更多的還原力和底物（甘油和HH）流向乳酸鹽的合成途徑，因此乳酸鹽的產(chǎn)量比批次發(fā)酵高。

3 結(jié)論

1）以HH為輔助底物與甘油共發(fā)酵，在3 L攪拌罐中進(jìn)行批次發(fā)酵，1，3-PDO的質(zhì)量濃度、甘油的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)力比甘油單獨發(fā)酵分別提高了18.2%，24.4%，18.0%；在7 L攪拌罐中進(jìn)行補料分批發(fā)酵，1，3-PDO的質(zhì)量濃度、甘油的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)力比甘油單獨發(fā)酵分別提高了17.8%，25.0%，17.7%。表明添加HH是提高發(fā)酵效率的經(jīng)濟(jì)可行的方法。

2）HH中的木糖和甘露糖能顯著提高1，3-PDO的產(chǎn)量和生物量，葡萄糖對1，3-PDO的合成產(chǎn)生抑制，而半乳糖和阿拉伯糖沒有影響。利用混合糖模擬HH，1，3-PDO的質(zhì)量濃度和生物量比甘油單獨發(fā)酵分別提高了17.8%和20.6%。

3）HH中的抑制物對發(fā)酵合成1，3-PDO有不同的影響。添加甲酸鹽時，對細(xì)胞生長和1，3-PDO的合成產(chǎn)生輕微抑制；而添加糠醛和乙酸鹽時，細(xì)胞生長和1，3-PDO質(zhì)量濃度均有不同程度的提高。

［1］ Ji Xiaojun，Huang He，Du Jun，et al. Enhanced 2，3-Butanediol Production by Klebsiella Oxytoca Using a Two-Stage Agitation Speed Control Strategy［J］. Bioresour Technol，2009，100（13）：3410 - 3414.

［2］ Selembo P A，Perez J M，Lloyd W A，et al. Enhanced Hydrogen and 1，3-Propanediol Production from Glycerol by Fermentation Using Mixed Cultures［J］. Biotechnol Bioeng，2009，104（6）：1098 - 1106.

［3］ Abbad-Andaloussi S，Amne J，F(xiàn)erard P，et al. Effect of Glucose on Glycerol Metabolism by Clostridium Butyricum［J］. J Appl Microbiol，1998，84（4）：515 - 522.

［4］ Saha B C. Hemicellulose Bioconversion［J］. J Ind Microbiol Biotechnol，2003，30（5）：279 - 291.

［5］ Ezeji T，Qureshi N，Blaschek H P. Butanol Production from Agricultural Residues：Impact of Degradation Products on Clostridium Beijerinckii Growth and Butanol Fermentation［J］.Biotechnol Bioeng，2007，97（6）：1460 - 1469.

［6］ Xu Qing，Li Shuang，F(xiàn)u Yongqian，et al. Two-Stage Utilization of Corn Straw by Rhizopus Oryzae for Fumaric Acid Production［J］. Bioresour Technol，2010，101（15）：6262 - 6264.

［7］ Martinez A，Rodriguez M E， York S W， et al. Effects of Ca(OH)2Treatments (“Overliming”) on the Composition and Toxicity of Bagasse Hemicellulose Hydrolysates［J］. Biotechnol Bioeng，2000，69（5）：526 - 536.

［8］ Yan Lishi，Zhang Hongman，Chen Jingwen，et al. Dilute Sulfuric Acid Cycle Spray Flow-Through Pretreatment of Corn Stover for Enhancement of Sugar Recovery［J］. Bioresour Technol，2009，100（5）：1803 - 1808.

［9］ Yang Guang，Tian Jiesheng，Li Jilun. Fermentation of 1，3-Propanediol by a Lactate Deficient Mutant of Kelbsiella Oxytoca Under Microaerobic Conditions［J］. Appl Microbiol Biotechnol，2007，73（5）：1017 - 1024.

［10］ Ragout A，Sineriz F，Diekmann H，et al. Shift in the Fermentation Balance of Lactobacillus Reuteri in the Presence of Glycerol Fermentation［J］. Biotechnol Lett，1996，18（9）：1105 - 1108.

［11］ Huang He，Gong C S，Tsao G T. Production of 1，3-Propanediol by Klebsiella Pneumonia［J］. Appl Biochem Biotechnol，2002，98（100）：687 - 698.

［12］ 朱曉麗，南南，修志龍. 以粗甘油為原料高產(chǎn)1，3-丙二醇菌株的等離子體復(fù)合誘變［J］. 過程工程學(xué)報，2011，11（6）：1030 - 1037.

［13］ Horváth I S，F(xiàn)ranzén C J，Mohammad J，et al. Effects ofFurfural on the Respiratory Metabolism of Saccharomyces Cerevisiae in Glucose-Limited Chemostats［J］. Appl Environ Microbiol，2003，69（7）：4076 - 4086.

［14］ Xue Xuedong，Li Wei，Li Zhimin，et al. Enhanced 1，3-Propanediol Production by Supply of Organic Acids and Repeated Fed-Batch Culture［J］. J Ind Microbiol Biotechnol，2010，37（7）：681 - 687.

［15］ Lü Fan，He Pinjing，Shao Liming，et al. Stress of pH and Acetate on Product Formation of Fermenting Polysaccharide-Rich Organic Waste［J］. Biochem Eng J，2008，39（1）：97 - 104.

［16］ He Qiang，Lokken P M，Chen Si，et al. Characterization of the Impact of Acetate and Lactate on Ethanolic Fermentation by Thermoanaerobacter Ethanolicus［J］. Bioresour Technol，2009，100（23）：5955 - 5965.

［17］ 師文靜，金平，王領(lǐng)民，等. 生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)1，3-丙二醇的技術(shù)進(jìn)展［J］. 精細(xì)與專用化學(xué)品，2010，18（4）：32 - 35.