香菇紫金Ⅰ號(hào)產(chǎn)木聚糖酶固體發(fā)酵條件及酶學(xué)性質(zhì)研究

王海燕，馮 炎

(金陵科技學(xué)院)

0 引言

啤酒糟，是以大麥為原料，經(jīng)發(fā)酵提取籽實(shí)中可溶性碳水化合物后的殘?jiān)?啤酒糟含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸及微量元素，謝幼梅等(1995)分析指出，啤酒糟干物質(zhì)中含粗蛋白25.13%、粗脂肪7.13%、粗纖維13.81%、灰分3.64%、鈣0.4%、磷0.57% ，其中無氮浸出物的主要成分是木聚糖.基于此，一些專業(yè)科研人員深入的探究了啤酒糟的利用價(jià)值，如制備功能性乳酸發(fā)酵纖維飲料所需的膳食纖維可從啤酒糟中提取;復(fù)合氨基酸營養(yǎng)液、蛋白飼料可利用啤酒糟發(fā)酵來生產(chǎn)等.［1-3］該試驗(yàn)試圖在添加其他輔料情況下，以啤酒糟作為主要原料，香菇紫金I號(hào)為菌種，在固態(tài)發(fā)酵條件下，研究了不同培養(yǎng)條件、不同培養(yǎng)基成分對(duì)木聚糖酶活性的影響.

1 材料與方法

1.1 材料

(1)菌種.香菇紫金I號(hào)來自金陵科技學(xué)院發(fā)酵工藝實(shí)驗(yàn)室.

(2)原料.啤酒糟由青島啤酒股份有限公司揚(yáng)州分廠提供.

1.2 試劑及配置

1.2.1 緩沖液

配制濃度為0.05 mol/L、pH為2.5～6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液和pH為6.5～7.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，用精密pH計(jì)校正.

1.2.2 培養(yǎng)基

(1)斜面培養(yǎng)基:磷酸二氫鉀(KH2PO4)1 g、馬鈴薯200 g、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5 g、蛋白胨 10 g、瓊脂20 g、VB12 粒、葡萄糖 20 g、水1000 mL、自然pH，于121℃下滅菌20 min.

(2)液體種子培養(yǎng)基:啤酒糟3g、葡萄糖15g、磷酸二氫鉀(KH2PO4)1 g、蛋白胨10 g、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5 g、馬鈴薯 200 g、水1000 mL、自然pH，于121℃下滅菌20 min.

(3)固體發(fā)酵培養(yǎng)基:硫酸鎂0.05 g、啤酒糟8 g、硫酸銨0.1 g、磷酸二氫鉀 0.05 g、麩皮 2 g，水30 mL，自然pH，121℃滅菌45 min.

1.2.3 底物的配制

1%的木聚糖溶液［4］.精確稱取燕麥木聚糖1 g于小燒杯中，加入約80 mL pH5.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，沸水浴加熱至全部溶解，冷卻后轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用緩沖液定容，4℃貯存?zhèn)溆?不超過3 d).

1.2.4 DNS試劑

該試驗(yàn)參考Miller［5］的文獻(xiàn)配置DNS試劑.

稱取10 g DNS溶于去離子水，依次加入10 g氫氧化鈉、200 g酒石酸鉀鈉，加熱溶解后，加2 g苯酚、0.5 g無水亞硫酸鈉，攪拌至全部溶解，冷卻，定容至1 L，貯于棕色瓶中，1 W后使用.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵過程

(1)斜面菌種培養(yǎng).在斜面培養(yǎng)基上接種上香菇紫金I號(hào)2塊菌絲，于25℃ 恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)6～7 d.

(2)液體種子培養(yǎng).將活化菌絲用無菌液體培養(yǎng)基進(jìn)行清洗(無菌條件下)，清洗后移入裝有80 mL液體種子培養(yǎng)基中(在250 mL三角瓶中進(jìn)行)，于25℃、160 rmp的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)6 d，備固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基用.

(3)固態(tài)發(fā)酵.于5 g/125 mL三角瓶中進(jìn)行，在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中(已滅菌)接種上已發(fā)酵好的液體種子，接種量為干料的20%，置于25℃ 恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)10 d.

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1)不同碳源配比影響:將碳源分別替換為啤酒糟6 g、玉米芯2 g、麩皮 2 g;啤酒糟 8 g和玉米芯2 g;啤酒糟10 g.

(2)氮源的影響:按培養(yǎng)基干料比的1%的量，考察以下6因素對(duì)氮源的影響:硝酸銨、牛肉膏、硫酸銨、黃豆粉、酵母膏、玉米粉.

(3)pH不同的影響:考察(基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基)起始 pH 分別為 4、5、6、7、8 時(shí)對(duì)酶活的影響.

(4)裝瓶量不同的影響:在125 mL的三角瓶中進(jìn)行，將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基按 3、5、7、9 g和11 g裝入三角瓶中，考察5個(gè)不同梯度因素的影響.

(5)培養(yǎng)天數(shù)不同的影響:按5個(gè)梯度來設(shè)定 7、8、9、10 和 11 d.

(6)料水比不同的影響:料水比設(shè)定為1∶2.8、1∶3.2、1∶3.6、1∶4.0 和 1:4.4.

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇碳源及組分配比，氮源添加量，pH，料水比，培養(yǎng)天數(shù)進(jìn)行5因素、4水平的正交實(shí)驗(yàn)，見表1，對(duì)以上5個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化.

表1 因素與水平表

1.3.4 粗酶液制備及酶活測定

(1)粗酶液制備:將50 mL 0.05 mol/L檸檬酸緩沖液(pH 4.8)加入到固態(tài)發(fā)酵好的培養(yǎng)物中，浸泡2 h(40℃)后過濾，再取濾液進(jìn)行冷凍離心，以6000 rmp離心15 min，取上清液即是粗酶液.

(2)木聚糖酶活力測定［6］:于15 mL干燥試管中加入0.1 mL上清液和1.9 mL 1%木聚糖溶液，放水浴鍋30 min(40℃)后，加入3.0 mL DNS試劑終止反應(yīng)，然后在沸水浴中進(jìn)行5 min顯色.冷卻后用去離子水定容至15 mL搖勻.于波長520 nm下測定OD值.

該文酶活力單位定義:50℃、pH 4.8條件下，每分鐘分解1%木聚糖溶液產(chǎn)生1 μg還原糖(以木糖)的酶量為一個(gè)木聚糖酶活力.即:

其中，N為稀釋度，W為酶反應(yīng)生成木糖的含量，μg;0.1為加酶量;30為酶解時(shí)間，min.

1.3.5 木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

(1)酶的最適pH:用pH為3～8緩沖液配制木聚糖溶液，然后分別加入0.1 mL粗酶液，水浴30 min(30℃)后加入3.0 mL DNS試劑，終止反應(yīng)，沸水浴5 min顯色，冷卻后用蒸餾水定容到15 mL，搖勻.空白樣對(duì)照:將酶液稀釋沸水浴15 min令其失活，測吸光度(其他條件不變)，計(jì)算其殘余木聚糖酶活力.

(2)酶的最適溫度:實(shí)驗(yàn)分別在 30、40、50、60、70和80℃的條件下，按1.3.4.2方法將粗酶液分底物反應(yīng)，測粗酶液最適合反應(yīng)溫度(酶活力最高者為100%).

(3)酶的pH穩(wěn)定性:將酶液分別用 pH為3、4、5、6、7 和 8 的緩沖液進(jìn)行稀釋，放水浴鍋中保溫(50℃)4 h，按1.3.4.2方法測定剩余酶活力(酶活力最高者為100%).

(4)木聚糖酶的熱穩(wěn)定性:酶活力最高者為100%計(jì)，實(shí)驗(yàn)分別在 30、40、50、60、70 和 80 ℃條件下將粗酶液放水浴鍋中保溫1 h，按1.3.4.2方法測定測粗酶液剩余酶活力.

2 結(jié)果與討論

2.1 固體發(fā)酵單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同配比的碳源對(duì)酶活力的影響

由圖1可知，單一碳源(即啤酒糟作為碳源時(shí))酶活力比較低，酶活力最高的是混合碳源即啤酒糟、玉米芯與麩皮3者混合物，啤酒糟和玉米芯混合物次之.

圖1 碳源不同對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.1.2 氮源對(duì)木聚糖酶活力的影響

由圖2可以看出，產(chǎn)木聚糖酶的活力最高的是酵母膏，為促進(jìn)菌株的產(chǎn)酶加入定量的酵母膏作為氮源是有益的.

圖2 氮源不同對(duì)酶的影響

2.1.3 不同pH對(duì)產(chǎn)木聚糖酶的影響

由圖3可知，產(chǎn)木聚糖酶最高的菌株是pH為5時(shí)，偏酸或偏堿都不利于酶活力的提高.由此可以看出菌絲細(xì)胞內(nèi)酸堿平衡、分解培養(yǎng)料的營養(yǎng)物質(zhì)時(shí)pH起到一定的調(diào)節(jié)作用.

圖3 不同pH對(duì)產(chǎn)木聚糖酶的影響

2.1.4 不同裝料量對(duì)產(chǎn)木聚糖酶的影響

測定不同裝料量發(fā)酵產(chǎn)物的酶活力，結(jié)果見圖4.

由圖4可知，裝瓶量為5 g時(shí)菌株產(chǎn)酶量最高.裝料量過多或者過少都影響產(chǎn)酶量.

2.1.5 料水比對(duì)產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

由圖5可看出，料水比為1∶3.2時(shí)酶活力最高.料水比不同產(chǎn)酶量而不同，菌體的生長、酶活力會(huì)因培養(yǎng)基水分太少而受限制;供氧和散熱條件會(huì)因水分過大而惡化，酶活力不高，菌體生長緩慢.因此，木聚糖酶合成的關(guān)鍵因素是培養(yǎng)基的含水量.

圖5 料水比不同對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.1.6 培養(yǎng)天數(shù)不同對(duì)產(chǎn)木聚糖酶的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基移入定量的菌種，酶活力從第7 d開始測，一天測一次，結(jié)果見圖6，培養(yǎng)天數(shù)不同酶活力不同，酶活力最高峰出現(xiàn)在第8 d，8 d以后，酶活力與天數(shù)成反比，這可能是由于長時(shí)間發(fā)酵產(chǎn)生了其他代謝產(chǎn)物，從而抑制了酶的活性.因此，培養(yǎng)天數(shù)以8 d最佳.

圖6 培養(yǎng)天數(shù)不同對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.2 產(chǎn)酶條件的正交優(yōu)化

產(chǎn)酶條件的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.

結(jié)果表明:16個(gè)處理中，產(chǎn)酶量存在一定的差異.影響產(chǎn)酶量因子依次是E﹥D﹥B﹥C﹥A.產(chǎn)酶條件的最優(yōu)組合為A2B3C2D1E3，即培養(yǎng)基中碳源為啤酒糟∶玉米芯∶麩皮 =6∶2∶2，氮源為1.5%酵母膏，料水比為:1∶3.2，最佳培養(yǎng)時(shí)間為8 d，在此培養(yǎng)條件下得到的酶活力最高.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 木聚糖酶部分酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 酶的最適pH

按1.3.5.1方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖7.

圖7 pH不同對(duì)酶活力的影響

由圖7可知，該酶的最適反應(yīng)pH為5，偏酸或偏堿的條件下，木聚糖的酶活力明顯下降.

2.3.2 酶的最適溫度

按1.3.5.2方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖8.

圖8 溫度不同對(duì)酶活力的影響

由圖8可知，木聚糖酶活力在50℃ 達(dá)到最高值，50℃之前隨著溫度的升高而增加，速度比較快，60℃后酶活力開始下降，下降速度很快.因此，木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為50℃ .

2.3.3 酶的pH穩(wěn)定性

按照1.3.5.3方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖9.

由圖9可知，木聚糖酶在pH為5時(shí)酶的相對(duì)酶活力達(dá)到最高值，幾乎為100%，在pH為4～6范圍內(nèi)酶活性較為穩(wěn)定，而且在pH為4～8范圍內(nèi)酶活力仍保留在50%以上，表明該酶系中可能有多種組分存在，因此該酶具有一定的耐酸和耐堿能力.

圖9 酶pH穩(wěn)定性

2.3.4 酶的熱穩(wěn)定性

按照1.3.5.4方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖10.

圖10 酶的熱穩(wěn)定性

由圖10可知木聚糖酶在40℃時(shí)酶的相對(duì)活力是100%，而且在30～60℃的范圍內(nèi)，相對(duì)酶活力仍保持在80%以上，說明該酶具有廣泛的熱穩(wěn)定性.

3 討論

由正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以看出，對(duì)木聚糖酶活力的影響因素依次為培養(yǎng)時(shí)間、料水比、氮源、pH和碳源，培養(yǎng)基.初始 pH對(duì)木聚糖酶的合成有較大影響，但在正交實(shí)驗(yàn)中，pH并不是主要的影響因素，因此，在生產(chǎn)中為控制培養(yǎng)基中的 pH變化可以在固體培養(yǎng)基中加入一些緩沖劑.

4 結(jié)論

香菇紫金I號(hào)以啤酒糟為主要原料產(chǎn)木聚糖酶的優(yōu)化碳源為:啤酒糟∶玉米芯∶麩皮 =6∶2∶2，氮源為1.5%的酵母膏，pH為5，裝瓶量5 g/125 mL三角瓶裝，接種量25%，培養(yǎng)天數(shù)8 d，料水比1∶3.2.

通過實(shí)驗(yàn)得出相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)，50℃是酶的最佳反應(yīng)溫度，最適pH為5，在pH為4～8范圍內(nèi)酶活力仍保留在50%以上，酶的相對(duì)活力是100%的溫度為40℃，相對(duì)酶活在30～60℃仍保持在80%以上.

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