真武湯對阿霉素所致大鼠腎損傷的治療作用*

李亞麗， 李志杰， 張 燕， 陸海英， 林 敏， 張 悅

(上海中醫(yī)藥大學(xué) 1科技實(shí)驗(yàn)中心, 2護(hù)理學(xué)院， 3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203)

真武湯對阿霉素所致大鼠腎損傷的治療作用*

李亞麗1， 李志杰1， 張 燕1， 陸海英2， 林 敏1， 張 悅3△

(上海中醫(yī)藥大學(xué)1科技實(shí)驗(yàn)中心,2護(hù)理學(xué)院，3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203)

目的研究真武湯對阿霉素腎病模型(adriamycin nephropathy，AN)大鼠足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白分子(podocin和nephrin)表達(dá)的影響，探討其防治阿霉素腎病大鼠蛋白尿的機(jī)制。方法采用常規(guī)生化、病理方法(包括HE染色、Masson染色及電鏡)觀察真武湯對AN模型所致纖維化大鼠腎功能、腎組織形態(tài)學(xué)變化及羥脯氨酸(Hyp)含量的改善作用；采用蛋白免疫印跡等方法探索真武湯對足細(xì)胞標(biāo)志蛋白podocin和nephrin信號分子表達(dá)的影響。結(jié)果模型組大鼠尿蛋白(TP)、血尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCr)顯著增加，肌酐清除率(CCr)顯著下降(P<0.05)；Hyp顯著增加(P<0.05)；腎組織podocin和nephrin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；腎小管萎縮，基底膜增厚；足突扁平、融合、消失。腎小球集中現(xiàn)象明顯；部分腎小管擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞變性，蛋白管型明顯；腎間質(zhì)纖維組織增生和較多炎癥細(xì)胞浸潤。與模型組相比，各治療組TP、BUN和SCr均有一定程度的下降，CCr顯著提高；Hyp明顯下降(P<0.05)；真武湯組腎組織podocin和nephrin蛋白表達(dá)水平顯著提高(P<0.05)；腎組織病變程度輕于模型組。結(jié)論真武湯能減少阿霉素腎病大鼠腎組織羥脯氨酸含量，改善腎功能及減輕病理損傷。 真武湯降低模型大鼠蛋白尿的作用可能與其維持足細(xì)胞podocin和nephrin的表達(dá)有關(guān)。

真武湯； 腎纖維化； 阿霉素； Podocin； Nephrin

蛋白尿是腎小球疾病的共同臨床表現(xiàn)，持續(xù)性蛋f白尿不僅是一個(gè)衡量病變情況的指標(biāo)，而且在進(jìn)行性腎臟疾病過程中，也是一個(gè)非常重要的致病因素。單側(cè)腎切除加尾靜脈注射阿霉素(adriamycin,ADR)所致腎小球硬化模型的突出表現(xiàn)是大量蛋白尿和小管間質(zhì)損害，具有慢性進(jìn)展性腎損害的特點(diǎn)，與人類局灶節(jié)段性腎小球腎炎的臨床表現(xiàn)相似。本研究主要觀察真武湯對阿霉素腎病(adriamycin nephropathy，AN)大鼠蛋白尿及腎小球硬化的治療作用，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 SPF級雄性SD大鼠95只，體重(170±10) g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，許可證號為SCXK(滬)2008-0016。

1.2藥物 真武湯方劑組成：茯苓、白術(shù)、白芍、生姜和制附子；由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥所水煎濃縮制劑，生藥量為1.2 kg/L。纈沙坦膠囊購自諾華制藥。注射用鹽酸表柔比星購自輝瑞制藥(無錫)有限公司。

1.3主要試劑 蘇木素(沃凱進(jìn)口分裝)；Sirius Red(Fluka)；PVDF膜(Millipore)；蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF;Amresco)；Complete Mini片(Roche)；磷酸酶抑制劑混合物Ⅱ(生工生物工程有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(Pierce)；羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)標(biāo)準(zhǔn)品(受贈于曙光醫(yī)院肝病所)；兔多抗podocin(Abcam)；兔多抗nephrin(Abcam)；小鼠單抗GAPDH(上?？党缮锕こ坦?；HRP偶聯(lián)山羊抗小鼠IgG單抗和HRP偶聯(lián)山羊抗兔IgG單抗(上海明睿生物科技有限公司)；蛋白marker(Fermentas)；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4主要儀器 全自動生化分析儀(Hitachi)；高速冷凍離心機(jī)(Thermo)；切片機(jī)(Leica)；自動包埋機(jī)(Leica)；透射電子顯微鏡(Philips-FEI)；電泳儀(Bio-Rad)；紫外透射分析儀(復(fù)日科技FR-200紫外與可見分析裝置)；全波長酶標(biāo)儀(BioTek Power Wave XS2)；倒置熒光顯微鏡(Olympus)；MicrosonXL2000超聲波破碎儀(Tayasaf)。

2方法

2.1阿霉素腎病模型制備及分組 全部大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組(normal)10只，假手術(shù)組(sham)10只，其余75只為造模組。以3%戊巴比妥鈉2 mL/kg 腹腔注射麻醉大鼠后，假手術(shù)組除不切除左腎外，其余均同造模組;造模組常規(guī)消毒，背部縱行切口，暴露左腎，剝離腎門周圍脂肪組織及腎上腺，結(jié)扎左腎，縫合切口。術(shù)后連續(xù)3 d肌注青霉素鈉(每只4 U)抗感染。1周后造模組(包括模型組與治療組)尾靜脈注射阿霉素溶液4 mg/kg，假手術(shù)組尾靜脈注射同等體積的生理鹽水。4周后造模組進(jìn)行第2次尾靜脈注射阿霉素溶液3 mg/kg，假手術(shù)組則尾靜脈注射同等體積的生理鹽水。所有造模組在切除左腎及第1次注射阿霉素之后，根據(jù)體重進(jìn)行隨機(jī)分組：模型組(model)15只、真武湯高劑量組(M+H)15只和真武湯中劑量(M+M)15只、真武湯低劑量組(M+L)15只、纈沙坦組(M+V)15只。真武湯中、低、高劑量生藥濃度分別為0.6、0.3和1.2 kg/L；纈沙坦給藥劑量為10 mg/kg；連續(xù)灌胃給藥8周。

2.2樣品采集 AN模型大鼠在給藥后第2周、第4周、第6周各組分別隨機(jī)選8只進(jìn)代謝籠，第8周(取材前1 d)所有大鼠均進(jìn)代謝籠，收集24 h尿液測尿量并檢測尿總蛋白(total protein，TP)和尿肌酐(urine creatinine，UCr)。取材當(dāng)天，3%戊巴比妥鈉以2 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠后，仰臥位固定，打開腹腔，觀察腎的色、質(zhì)、形態(tài)、體積、粘連等情況。經(jīng)腹主動脈采血，摘取右側(cè)腎臟，稱腎臟重量。所采血液4 ℃靜置3 h后，3 000 r/min，15 min離心2次，分離血清，檢測血清肌酐(serum creatinine，SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，其余血清-80 ℃凍存。切取右側(cè)腎臟的1/3大小，以10%中性甲醛固定，送病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)石蠟切片的制備和HE 染色。切取腎皮質(zhì)和皮、髓交界處組織，體積1 cm×1 cm×1 cm，固定于2%戊二醛內(nèi)，4 ℃冰箱內(nèi)保存，送電鏡室進(jìn)行超薄切片的制備，用于電鏡觀察。剩余腎組織分裝后，迅速放入液氮中，隨后-80 ℃保存。

3觀察指標(biāo)

3.1一般情況 觀察大鼠體重、毛色、精神狀況和死亡情況。

3.2TP、UCr、SCr和BUN的測定 由上海中醫(yī)藥大學(xué)GLP中心全自動生化分析儀檢測完成。

3.3腎組織Hyp測定 采用Jamall法測定Hyp含量。稱取100 mg腎組織(濕重)，加入2.5 mL雙蒸水，冰浴超聲勻漿，將勻漿液裝入10 mL安瓿中，加2.5 mL濃鹽酸，105 ℃水解20 h。過濾，取水解液100 μL，40 ℃烘干48 h。取Hyp標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.01 g/L)0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、120 μL和160 μL，分別加50%異丙醇1.2 mL，氯胺T工作液0.2 mL，室溫放置10 min后加入ER工作液(Ehrlich’s reagent solution，為25%對二甲基氨基苯甲醛和27.3%高氯酸的異丙醇溶液)1 mL，振蕩混勻，50 ℃水浴90 min，讀取A558值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同上反應(yīng)系中以樣本代替Hyp標(biāo)準(zhǔn)品，讀取A558。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Hyp含量。

3.4腎組織病理觀察

3.4.1HE染色 取腎皮質(zhì)，10%中性甲醛固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，制成3 μm的石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，水洗3次，置于蘇木素7 min，水洗3次，70 ℃水藍(lán)化15 min，伊紅染液30 s，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固(由上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞生物學(xué)與組織病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成)。

3.4.2Masson染色 常規(guī)脫蠟至水，于Bouin固定液60 ℃ 溫箱1 h，流水沖洗后，浸入蘇木素染色液10 min，流水沖洗后放入Masson復(fù)合染色液20 min，蒸餾水沖洗后放入5%磷鉬酸6 min，傾去磷鉬酸后放入2%亮綠染色液7 min，2%醋酸水溶液2 min，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

3.4.3透射電鏡觀察 取腎皮質(zhì)，制成1 mm×1 mm×1 mm的小立方體，保持低溫環(huán)境下2%戊二醛固定液固定2h以上，0.1 mol/L磷酸緩沖液充分洗滌；1%鋨酸后固定2 h，磷酸緩沖液清洗0.5 h；梯度乙醇脫水；浸透；經(jīng)脫水、浸透、包埋，制成超薄切片在電鏡下觀察。

3.5腎組織podocin和nephrin蛋白表達(dá)分析

3.5.1腎皮質(zhì)總蛋白的提取及蛋白定量 取腎皮質(zhì)約100 mg，置于1.5 mL EP管內(nèi)，加入預(yù)冷的RIPA裂解液1 mL(Complete Mini片30 μL+磷酸酶抑制劑10 μL)，另加PMSF 10 μL，混勻，于冰浴中超聲勻漿裂解成漿液，再4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清入另一1.5 mL EP管中，12 000 r/min再次離心15 min。按照BCA蛋白定量試劑盒操作步驟取少量上清進(jìn)行蛋白濃度測定，將蛋白樣品調(diào)至同等濃度，于100 ℃煮沸變性10 min，冰浴5 min后-80 ℃冰箱保存。

3.5.2Western blotting檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 將調(diào)好濃度的蛋白樣品加到各泳道，堆積膠80 V，分離膠120 V進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜1～1.5 h(經(jīng)甲醇處理的PVDF膜)。將轉(zhuǎn)有蛋白的PVDF膜以5%脫脂奶粉室溫?fù)u蕩封閉1 h。加入Ⅰ抗工作液(podocin 1∶2 000；nephrin 1∶400)，4 ℃搖蕩過夜。TBST洗膜10 min×3次后，加入Ⅱ抗工作液(1∶5 000)，室溫?fù)u蕩孵育2 h。TBST洗膜10 min×3次。A、B發(fā)光液以1∶1的比例混合。將PVDF膜正面覆于A、B混合液上，置于暗盒中，，并根據(jù)所見熒光強(qiáng)度選擇合適的時(shí)間曝光。取出膠片，標(biāo)定marker與目的蛋白，進(jìn)行掃描與分析。利用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參照的比值(相對灰度值)。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1一般情況

造模前各組大鼠均行動靈活，反應(yīng)敏捷，皮毛光良柔順，大便呈顆粒狀。術(shù)后模型組及治療組較之假手術(shù)組體重增長緩慢，并且出現(xiàn)活動減少，應(yīng)激反應(yīng)減弱，倦怠，精神萎靡，相互擁擠，蜷縮成團(tuán)，皮毛亮度和柔順感降低，有脫毛現(xiàn)象，大便多稀薄，尤其在2次注射阿霉素之后，肛周多污染。各造模組大鼠舌質(zhì)多淡白，尾涼，未見水腫現(xiàn)象發(fā)生。少數(shù)大鼠由于尾靜脈注射阿霉素時(shí)藥物滲出體外，有不同程度的潰爛現(xiàn)象。

假手術(shù)組與正常組相比，體重?zé)o明顯差異；與正常組相比，模型組體重在第4周、第6周和第8周顯著下降，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，用藥組體重?zé)o明顯差異,見表1。

表1 各組大鼠體重比較

*P<0.05vsnormal group.

2各組大鼠24h尿TP及血液生化指標(biāo)比較

假手術(shù)組與正常組相比， TP、UCr、BUN、SCr及肌酐清除率(clearance of creatinine，CCr)均無明顯差異；與正常組比較，模型組TP、BUN和SCr顯著增加，CCr顯著下降，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，各治療組TP、BUN和SCr均有一定程度的下降，CCr顯著提高，表明真武湯及纈沙坦有一定的改善腎功能作用,見表2。

表2 各組大鼠24 h尿蛋白總量及血液生化指標(biāo)比較

*P<0.05vsnormal；△P<0.05vsmodel.

3各組大鼠腎組織Hyp變化

假手術(shù)組與正常組相比， Hyp無明顯差異；與正常組比較，模型組Hyp顯著增加，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，真武湯高、中、低劑量組及纈沙坦組Hyp明顯下降，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

4各組大鼠腎組織病理變化

4.1HE染色 模型大鼠腎小球節(jié)段性硬化，硬化的腎小球周圍所屬腎小管萎縮、基底膜增厚；腎小球集中現(xiàn)象明顯；部分腎小管擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞變性，蛋白管型明顯；腎間質(zhì)纖維組織增生和較多炎癥細(xì)胞浸潤。真武湯和纈沙坦組大鼠腎組織病變程度輕于模型組,見圖1。

Figure 1. The pathological changes of rat renal tissues in diffe-rent groups(HE staining，×400). A: model+high dose of Zhenwu decoction;B: model+middle dose of Zhenwu decoction;C: model+low dose of Zhenwu decoction;D:sham; E: model;F: model+valsartan.

圖1各組大鼠腎組織的病理變化

4.2Masson染色 假手術(shù)組大鼠的腎小球基底膜和系膜區(qū)的膠原成分被亮綠染成綠色，腎小管基底膜也被染成綠色，腎組織的其它部分未見陽性染色。模型大鼠的腎小球和腎小管基底膜增厚，腎間質(zhì)中出現(xiàn)染成綠色的膠原纖維增多。真武湯和纈沙坦干預(yù)組大鼠腎間質(zhì)膠原染色少于模型組，見圖2。

Figure 2. The changes of collagen fibers in rat renal tissues in different groups(Masson staining，×400). A:sham;B: model;C: model+valsartan;D: model+middle dose of Zhenwu decoction.

圖2各組大鼠腎組織膠原纖維的變化

4.3電鏡觀察 正常組和假手術(shù)組大鼠的腎小球基底膜完整平滑，管腔內(nèi)可見紅細(xì)胞，基底膜外側(cè)的足細(xì)胞胞體較大，足突排列整齊，足突間裂隙均勻。模型組大鼠的足突扁平、融合、消失。各治療組的大鼠足細(xì)胞融合、扁平情況輕于模型組，部分基底膜區(qū)域可見整齊的足突，見圖3。

5真武湯對AN大鼠podocin和nephrin蛋白表達(dá)的影響

5.1各組大鼠腎組織podocin蛋白表達(dá)的比較 假手術(shù)組與正常組相比，腎組織podocin蛋白表達(dá)水平無明顯差異；與正常組相比，模型組大鼠腎組織podocin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，真武湯用藥組腎組織podocin蛋白表達(dá)水平顯著提高(P<0.05)；纈沙坦用藥組與模型組無顯著差異，見圖4。

Figure 3. The ultrastructural changes of rat renal tissues in different groups observed under transmission electron microscope (×6 000). A: sham; B: normal; C: mo-del; D: model+valsartan; E: model+high dose of Zhenwu decoction; F: model+middle dose of Zhenwu decoction; G: model+low dose of Zhenwu decoction.

圖3各組大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)的變化

5.2各組大鼠腎組織nephrin蛋白表達(dá)的比較 假手術(shù)組與正常組相比，腎組織nephrin蛋白表達(dá)水平無明顯差異；與正常組相比，模型組大鼠腎組織nephrin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，真武湯用藥組腎組織nephrin蛋白表達(dá)水平顯著提高(P<0.05)；纈沙坦用藥組與模型組無顯著差異，見圖5。

討 論

作為一種強(qiáng)效的抗腫瘤藥物[1]，鹽酸阿霉素可在腎臟內(nèi)代謝還原為半醌型自由基，自由基與氧反應(yīng)生成活性氧族，從而誘發(fā)腎小球上皮細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，破壞腎小球?yàn)V過膜的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生[2]。腎小球內(nèi)固有細(xì)胞及其它炎癥細(xì)胞在阿霉素及蛋白尿的刺激下會產(chǎn)生并釋放各種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞增殖和系膜基質(zhì)增多，緩慢發(fā)展成腎小球硬化[2]。單側(cè)腎切除加尾靜脈注射阿霉素所致的腎病模型，與人類進(jìn)行性腎臟疾病的表現(xiàn)非常類似，從最初使用[3]至今已得到國內(nèi)外學(xué)者的公認(rèn)。

Figure 4. Protein expression of podocin detected by Western blotting. Lane 1:normal; Lane 2:sham; Lane 3:model; Lane 4: model+valsartan; Lane 5: model+high dose of Zhenwu decoction; Lane 6: model+middle dose of Zhenwu decoction; Lane 7: model+low dose of Zhenwu decoction. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal；△P<0.05vsmodel.

圖4各組大鼠腎組織podocin蛋白表達(dá)比較

Figure 5. Protein expression of nephrin detected by Western blotting.Lane 1:normal; Lane 2:sham; Lane 3:model; Lane 4: model+valsartan; Lane 5: model+high dose of Zhenwu decoction; Lane 6: model+middle dose of Zhenwu decoction; Lane 7: model+low dose of Zhenwu decoction. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal；△P<0.05vsmodel.

圖5各組大鼠腎組織nephrin蛋白表達(dá)比較

此外，阿霉素腎病模型還較為符合中醫(yī)理論的腎陽虛動物模型。董興剛等[4]用腎切除加阿霉素注射法誘導(dǎo)腎陽虛證動物模型：將大鼠先行右腎切除，術(shù)后第1周和第5周時(shí)分別注射阿霉素，觀察12周后取材。結(jié)果可見大鼠日漸消瘦、畏寒肢冷、精神萎靡、蜷縮拱背、便溏、浮腫及腹水，并且體毛有脫落現(xiàn)象 ，性功能及交配能力低下，腎臟呈“大白腎”，這種腎陽溫煦生化功能不足，水液代謝異常，性交配功能衰弱癥候，與中醫(yī)理論腎為“先天之本，主一身之元陽，主生長發(fā)育衰老，主骨藏精，主生殖，司水液，合三焦”比較相符，由于本次實(shí)驗(yàn)中的真武湯為治療脾腎陽虛的經(jīng)典方，因此選擇阿霉素腎病模型，以證論方，也符合中醫(yī)藥研究中的反證原則。

足細(xì)胞裂隙的損傷、足突的融合甚至消失是阿霉素腎病大鼠的主要病理改變。長期暴露在大量尿蛋白之中的足細(xì)胞，可促使其轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)的表達(dá)增加，系膜細(xì)胞又可在TGF-β1的旁分泌作用下形成肌成纖維細(xì)胞，促使各種腎臟細(xì)胞膠原的轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)而加速腎小球硬化[5]。除此之外，國內(nèi)外的一些研究也同樣證實(shí)許多“足細(xì)胞相關(guān)分子”與高度分化的足細(xì)胞有著密切聯(lián)系[6]，如nephrin和podocin是已發(fā)現(xiàn)的維持足細(xì)胞裂孔隔膜結(jié)構(gòu)功能的重要蛋白分子。Nephrin 是在足細(xì)胞裂孔隔膜發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)跨膜糖蛋白，主要存在于相鄰足突間的裂孔隔膜處，作為裂孔隔膜復(fù)合體的主要成分之一，nephrin的主要作用是在足突與足突之間形成“拉鏈”樣結(jié)構(gòu)，維持裂孔隔膜功能及腎小球?yàn)V過膜的通透性。在人類，編碼nephrin的基因NPHS1的突變可導(dǎo)致芬蘭型先天性的腎病綜合癥。Barutta等[7]通過鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型，通過Western bloting、免疫組化等方法發(fā)現(xiàn)小鼠腎臟組織的nephrin蛋白表達(dá)有所下降。Podocin是繼nephrin之后發(fā)現(xiàn)的一種呈發(fā)夾樣的特異表達(dá)于SD的膜蛋白。編碼podocin的NPHS2基因突變主要表現(xiàn)為兒童早期的蛋白尿，繼而進(jìn)展為局灶階段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)及終末期腎衰竭[8]。Hinkers等[9]研究證實(shí)，podo-cin羧基末端與nephrin羧基末端相互作用，可參與nephrin與細(xì)胞骨架的連接，從而加強(qiáng)nephrin所誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。李志杰等[10]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用黃芪多糖干預(yù)后，可以減輕糖尿病腎臟病理改變，降低血糖，同時(shí)維持nephrin和podocin蛋白的表達(dá)。

足細(xì)胞裂隙的nephrin和podocin蛋白表達(dá)在注射阿霉素1周后即可出現(xiàn)明顯降低，同時(shí)伴有尿蛋白含量的明顯增加[11-12]，說明足細(xì)胞足突的結(jié)構(gòu)功能受損，與構(gòu)成裂孔隔膜的相關(guān)分子表達(dá)、分布和代謝異常有著密切的聯(lián)系。因此，控制蛋白尿?qū)τ谘泳從I病進(jìn)展具有重要意義。Hyp是膠原蛋白中的重要成分，占有較為固定的比例，通過測定羥脯氨酸來反映膠原的含量，從而可以評價(jià)腎組織纖維化的程度。

真武湯出自《傷寒論》辨少陰病證并治中第316條:少陰病，二三日不已，至四五日，腹痛，小便不利，四肢沉重疼痛，自下利者，此為有水氣，其人或咳，或小便利，或下利，或嘔者，真武湯主之。成無己《傷寒明理論》亦云：“真武北方水神也，而屬腎，用以治水焉。水氣在下，外帶表而屬陽，必應(yīng)發(fā)散，故治以真武湯?！?真武湯為臨床應(yīng)用多年的溫陽化水、治療脾腎陽虛的中醫(yī)經(jīng)典復(fù)方，全方由附子、茯苓、白術(shù)、白芍、生姜五味藥組成，臨床有許多真武湯的相關(guān)報(bào)道，如真武湯在治療腎病綜合癥、慢性腎小球腎炎、慢性腎功能衰竭等疾病方面均有不錯(cuò)的療效[13]?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，真武湯能夠提高心肌收縮力，增加尿量，減少抗利尿激素(antidiuretic hormone, ADH)的分泌，促進(jìn)Na+和K+的排泄，從而改善腎小球?yàn)V過膜的通透性，促使代謝產(chǎn)物SCr和BUN的排除，減少血漿白蛋白的大量丟失，對機(jī)體的免疫功能有增強(qiáng)作用[14]。

血管緊張素Ⅱ與腎小球硬化有著緊密的聯(lián)系，它不僅調(diào)節(jié)球內(nèi)血液動力學(xué)的改變，與球內(nèi)系膜細(xì)胞的增生及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積也有一定的關(guān)系。由于纈沙坦是一種口服有效的特異性的血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，所以本次研究中選擇纈沙坦作為陽性對照藥物。

在本次實(shí)驗(yàn)中，真武湯除了可以顯著降低模型組24 h尿蛋白含量之外，在其它指標(biāo)上，用真武湯水煎劑及纈沙坦灌胃治療后，各治療組大鼠血肌酐、尿肌酐、血尿素氮和內(nèi)生肌酐清除率均趨向正常；腎組織羥脯氨酸含量較模型組顯著減少；病理觀察腎間質(zhì)纖維化程度、腎小球及其足細(xì)胞結(jié)構(gòu)也較模型組明顯好轉(zhuǎn)，表明真武湯在一定程度上可以改善腎功能，并能夠有效防治腎間質(zhì)纖維化。真武湯降低模型大鼠蛋白尿的作用可能與其維持足細(xì)胞podocin和nephrin的表達(dá)有關(guān)。

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EffectsofZhenwudecoctiononratkidneyinjuryinducedbyadriamycin

LI Ya-li1, LI Zhi-jie1, ZHANG Yan1, LU Hai-ying2, LIN Min1, ZHANG Yue3

(1ExperimentCenterforScienceandTechnology,2SchoolofNursing,3BasicMedicalCollege,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China.E-mail:yuezhang_shanghai@yahoo.com.cn)

AIM: To observe the effects of Zhenwu decoction on the expression of podocin and nephrin in podocytes of adriamycin nephropathy (AN) rats, and to clarify the mechanism of Zhenwu decoction in decreasing adriamycin-induced proteinuria in rats.METHODSBiochemical assay and pathological observation (HE staining, Masson trichrome staining and transmission electron microscopy) were used to evaluate the effects of Zhenwu decoction on renal function, pathological morphology and hydroxyproline (Hyp) content in AN rats with renal fibrosis. Western blotting was used to observe the effect of Zhenwu decoction on the expression of podocin and nephrin which are marker proteins in podocytes.RESULTSIn model group, the levels of urinary total protein (TP), blood urea nitrogen (BUN), serum creatinine (SCr) and renal Hyp were significantly increased, and the clearance of creatinine (CCr) level was decreased (P<0.05). The expression of podocin and nephrin was significantly decreased (P<0.05). Atrophic renal tubules, thickened basement membranes, fusion of foot processes, concentrating renal glomerules, expansion of some renal tubules, degeneration of renal tubular epithelial cells, protein casts, and proliferation of fibroblasts and infiltration of inflammatory cells in renal interstitium were also observed. After treatment with drugs (Zhenwu decoction and valsartan), the above-mentioned parameters were significantly changed. TP, BUN, SCr and Hyp were down-regulated to different levels, and CCr was significantly up-regulated (P<0.05). The expression of podocin and nephrin was up-regulated by treatment with Zhenwu decoction, and renal histological changes were alleviated compared with model group.CONCLUSIONZhenwu decoction can reduce Hyp content in kidney tissue, alleviate kidney histological changes, and improve renal function in AN rats. It might protect kidney against adriamycin-induced proteinuria via increasing the expression of podocin and nephrin in podocytes.

Zhenwu decoction; Renal fibrosis; Adriamycin; Podocin; Nephrin

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.014

1000- 4718(2013)11- 1994- 07

2013- 04- 04

2013- 09- 03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81173406)；上海市教育委員會重點(diǎn)學(xué)科(第5期)項(xiàng)目(No.J50301)；上海高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目

△通訊作者 Tel： 021-52313103； E-mail: yuezhang_shanghai@yahoo.com.cn