一株綠僵菌的分離鑒定及對桃小食心蟲的致病力研究

王剛，熊琦，田芬，謝映平，薛皎亮

（山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006）

0 引言

桃小食心蟲（Carposina sasakii），簡稱桃小，隸屬昆蟲綱Insecta鱗翅目Lepidoptera蛀果蛾科Carposinldae.桃小食心蟲在我國北方對果樹危害嚴重［1］，是北方果樹生產中發(fā)生面積最廣、危害最大的食心蟲類害蟲之一.它可危害棗、蘋果、梨、桃、杏等10多種果樹的果實，通過幼蟲蛀食果肉，在孔道和果核周圍殘留大量蟲糞，嚴重影響果品的產量和質量［2］.幼蟲在發(fā)育后期株危害率幾乎達到100%，果危害率達80%以上，對果樹損害巨大［3］.

利用昆蟲病原真菌防治桃小食心蟲是生物防治中的重要手段之一，具有顯著的流行潛力，容易大量生產，且安全有效，在防治過程能保證果品安全.因此，獲得高致病力的病原真菌菌株尤為重要.朱艷婷等［4］用不同來源寄主上的14株白僵菌菌株侵染桃小食心蟲，獲得3株高致病力的優(yōu)良菌株；朱永敏等［5］從桃小食心蟲越冬繭自然染病蟲尸上，分離純化得到3株桃小食心蟲的病原真菌，其中兩株菌株為鐮孢屬，另外一株為擬青霉屬.國內尚少見關于從桃小食心蟲越冬繭自然染病蟲尸上分離純化得到綠僵菌（Metarhizium）的報道.綠僵菌是一種重要的生防真菌，全球大概200多種昆蟲可被綠僵菌感染致死［6］.

樊美珍等［7］證明了綠僵菌對桃小食心蟲有良好的防治效果，具有用量少、成本低等優(yōu)點，葉斌［8］等人還證實了綠僵菌具有一定的耐高溫和耐旱性.目前利用綠僵菌防治的靶標害蟲中，對于鞘翅目（蠐螬）、直翅目（蝗蟲）、同翅目（蚜蟲、粉虱、葉蟬）的研究報道比較多，而對于鱗翅目害蟲報道較少.因此，篩選能夠感染桃小食心蟲的綠僵菌新菌株，對于防治鱗翅目害蟲十分重要.

Driver［9］等對121株綠僵菌實驗菌株ITS序列進行分析，并將綠僵菌劃分為3個種，金龜子綠僵菌下有3個變種.但是單純地依靠菌株的形態(tài)特征或分子生物學方法都存在一定的不足，將兩者結合用于系統分類有助于更好地解決真菌分類的難題.

本研究經室內培養(yǎng)分離、光學顯微鏡和掃描電鏡的形態(tài)特征觀察，以及DNA-ITS基因序列分析，鑒定出編號為TSL06的菌株為金龜子綠僵菌.并用濃度為1.2×109孢子／mL懸液侵染桃小食心蟲，校正致死率達到86.08%，該菌株有較強的毒力，可為我國北方桃小食心蟲的生物防治提供新的菌種資源和應用依據.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

桃小食心蟲蟲尸來源于山西臨汾地區(qū)襄汾景毛鄉(xiāng)果園.

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：土豆200g、葡萄糖18g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL.

1.1.3 回接實驗的蟲源

用健康的桃小食心蟲幼蟲作為回接試驗昆蟲.2012年9月份從山西臨汾地區(qū)襄汾景毛鄉(xiāng)果園采集團棗的落果，放置于室內，讓桃小食心蟲幼蟲自然從果實中鉆出，收集健康蟲體，用于試驗.

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離和純化

在無菌的CJ-C系列潔凈工作臺中將自然染菌的桃小食心蟲蟲尸，每頭平均剪成3塊，在體積分數為75%的酒精中浸泡3s，接著在質量體積比（0.1g Hg溶于100mL蒸餾水中）0.1%的汞水中消毒3min，之后用無菌水沖洗蟲尸3次，最后將處理好的蟲尸呈等邊三角形放入含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中.將培養(yǎng)皿放在25℃的SPX-250I-C型人工氣候箱中培養(yǎng)5d，劃線分離長出的菌株，并重復培養(yǎng)劃線分離3-5次，直到得到純菌株.

1.2.2 孢子懸液的制備

將純化培養(yǎng)好的菌株用接種環(huán)移入到10mL含有質量濃度為0.1%吐溫-80無菌水溶液的三角瓶中，在85-2型磁力攪拌器上充分攪拌使孢子均勻分散在溶液中，用血球計數板測定孢子濃度，并將孢子懸液調配成所需要的濃度.

1.2.3 回接殺蟲實驗

用2012年9月份采集的健康桃小食心蟲幼蟲做回接實驗.6.0×108孢子／mL的孢子懸液感染健康的桃小食心蟲，將接菌后的桃小食心蟲置于無菌培養(yǎng)缸中，在25℃、70%相對濕度下培養(yǎng)并觀察蟲體的感染情況.

1.2.4 菌落形態(tài)的觀察

用移液槍吸取孢子懸液10μL，滴在PDA平板中，每個培養(yǎng)皿滴3滴，呈等邊三角形，在（25±1）℃條件下連續(xù)培養(yǎng)，每天觀察記錄菌落特征，并測量菌落直徑.

1.2.5 菌株在光學顯微鏡下的顯微結構觀察

采取的是載片培養(yǎng)法［10］.根據需要在不同的培養(yǎng)時間取出載玻片，置于OLYMPUS BX51光學顯微鏡下觀察，并用配套的OLYMPUS數碼相機C-5050ZOOM拍照記錄菌落的顯微結構特征，參照賀運春［11］和李增智［12］對綠僵菌形態(tài)分類的描述進行分類鑒定.

1.2.6 菌株在掃描電鏡下的顯微結構觀察

采用插片培養(yǎng)法［10］培養(yǎng)一個星期后，取出蓋玻片，用質量濃度為2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脫水，每個梯度10min，EMS850臨界點干燥器中干燥，15kV、20mA下噴金，在JSM-840型掃描電鏡下觀察拍照.

1.2.7 菌株的分子鑒定

采用CTAB法提取DNA［13］.先在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)大量的菌株，用液氮研磨，通過水浴、離心等，將提取的DNA在4℃下溶于TE水中，保存?zhèn)溆?以待測菌株基因組DNA為模版，用ITS序列通用引物ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）和ITS5（5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’），在 Master cyoer 5331Eppendorf PCR擴增儀上進行擴增，擴增條件為94℃ 預變性5min；94℃ 變性1min，50℃ 復性1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)；最終72℃延伸10min.取PCR產物5μL于1.5% 的瓊脂糖凝膠上電泳，用DNA Marker指示分子量.將電泳完的膠板放于凝膠成像系統上觀察并照相，來檢測PCR產物的純度和含量大小，合格后送生物工程（上海）有限公司測序.用Sequencher軟件進行分析得到DNA序列，與NCBI數據庫中的已知真菌DNA序列進行比較確定該菌株的種屬地位.

1.2.8 致病率試驗

制備5個濃度的孢子懸液，孢子濃度分別為1.2×109孢子／mL、6.0×108孢子／mL、1.2×108孢子／mL、6.0×107孢子／mL、1.2×107孢子／mL.用浸染法接種健康的桃小食心蟲，對照組為無菌蒸餾水處理，接菌后將桃小食心蟲置于無菌培養(yǎng)盒內，盒內放一層保濕濾紙，每盒放30頭桃小食心蟲，每個濃度做3組，在25℃、70%相對濕度下培養(yǎng).感染后連續(xù)觀察10d，并記錄各濃度處理組和對照組的累計死亡率.

2 結果與分析

2.1 自然感染死亡的桃小食心蟲和分離純化得到的菌株

從桃小食心蟲越冬蟲繭中發(fā)現自然染菌的蟲體表面有綠色的真菌寄生（圖1A）在蟲尸上，經劃線分離純化得到的一株綠僵菌（圖1B），編號為TSL06菌株（TS為桃小食心蟲的縮寫，L為采集地臨汾縮寫）.

圖1 自然染菌的桃小食心蟲和從蟲尸上分離純化的TSL06菌株Fig.1 Naturally diseased peach fruit moth larva and the strain of TSL06separated and purified from insect carcasses

2.2 回接殺蟲實驗結果

將分離獲得的TSL06菌株制備成濃度為6.0×108孢子／mL的孢子懸液，接種桃小食心蟲.接菌后第2天，蟲體開始變得不活躍；第3天出現死亡，且蟲體表面顏色變暗（圖2A）；第4天蟲體表面長出白色菌絲，菌絲最先出現在頭部和尾部（圖2B-2C）；第5天菌絲上長出綠色孢子，隨后孢子繼續(xù)增多；第8天蟲體表面已布滿菌絲和孢子（圖2D），蟲體干癟，因此說明該菌株是桃小食心蟲的致病菌.

圖2 染菌后的桃小食心蟲幼蟲Fig.2 Diseased larvae of peach fruit moth

2.3 菌落的形態(tài)特征

培養(yǎng)狀況：在PDA培養(yǎng)基上，25℃條件下培養(yǎng)7d后，菌落平均直徑為34mm，呈圓形，不透明.培養(yǎng)初期菌落為絨毛狀白色菌絲，邊緣較圓滑（圖3A）；第4天開始產生孢子（圖3B），菌落中央孢子圈不斷擴大，顏色逐漸變?yōu)槟G色，中間凸起邊緣較整齊、平展，絨毛狀，表面干燥且菌落不透明（圖3C），菌落背面呈棕黃色（圖3D）.

圖3 TSL06菌株培養(yǎng)形狀Fig.3 Cultural characters of the strain TSL06

形態(tài)特征：在光學顯微鏡下，可以看到分生孢子梗上長有柱形或瓶形的小梗，小梗頂部產分生孢子，分生孢子長橢圓形，菌絲無色透明，直徑1.7～2.1μm（圖4A）.分生孢子梗末端的小梗常對生或者輪生（圖4B）.通過掃描電鏡可以進一步看到，分生孢子梗上有隔，直徑2.2～2.8μm（圖4C）.分生孢子表面較光滑，呈長橢圓形，兩端鈍圓，大小（5.2～7.7）μm×（2.7～3.1）μm（圖4B、圖4D）.

圖4 TSL06菌株形態(tài)特征Fig.4 Morphological characteristics of the strain TSL06

通過形態(tài)鑒定，初步判斷該菌株為綠僵菌屬的金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae（Metsch.）Sorokin）.

2.4 菌株的分子鑒定結果

先用CTAB法提取TSL06菌株的DNA，對提出的DNA進行PCR擴增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增的DNA片段的含量和純度（圖5），并分別以ITS4和ITS5為引物進行ITS測序，將菌株的ITS序列測定結果在NCBI中進行Blast比對.結果顯示，該菌株與金龜子綠僵菌的相似度為100%.

結合菌株形態(tài)鑒定，最終確定該菌株為綠僵菌屬的金龜子綠僵菌.

2.5 不同濃度TSL06孢子懸液對桃小食心蟲幼蟲的致死率

桃小食心蟲在染菌后第1天基本沒有死亡；第2天5個濃度孢子懸液處理組的幼蟲活力都表現下降，且每組都出現少數死亡的情況；第3天死亡蟲數繼續(xù)增加；第4-7天是各染菌組蟲體死亡的高峰期；第8天后死亡數量逐日減少.5個濃度相比，孢子懸液的濃度越高，對幼蟲的致死效果越好.染菌10天后，最低濃度1.2×107孢子／mL感染下校正死亡率達到37.66%，最高濃度1.2×109孢子／mL 校正死亡率達到85.71%，是最低濃度的2.3倍（圖6）.LC50為3.86×107孢子／mL，PROBIT（p）＝-4.854＋0.640 X，孢子懸液不同濃度之間存在一定的顯著性差異（P＜0.05）（表1），表明孢子懸液在不同濃度下，毒力相差比較大.

圖5 菌株TSL06特異引物擴增產物電泳圖譜Fig.5 Agarose gel of PCR products of TSL06

圖6 五個濃度孢子懸液對桃小食心蟲幼蟲校正致死率的比較Fig.6 Comparison of corrected mortality of peach fruit moth larvae infected by the spore suspension in five concentrations

表1 五個濃度孢子懸液對桃小食心蟲幼蟲的校正死亡率Table 1 Corrected mortality of peach fruit moth larvae infected by fungal spore suspension in five concentrations

3 討論

本研究從自然染病的桃小食心蟲蟲尸上分離純化出1株蟲生真菌，鑒定為綠僵菌屬的金龜子綠僵菌菌株.用其不同的孢子濃度侵染桃小食心蟲，最高濃度的校正致死率達到86.08%，說明該菌株是桃小食心蟲的病原真菌，且具有較強的致病力.

綠僵菌是一種重要的昆蟲病原真菌.國內外關于蟲生真菌防治害蟲的研究很多，研究最多的病原真菌是白僵菌、綠僵菌等病原真菌.綠僵菌是一種高效環(huán)保的生物試劑［14］，近年來世界各地用綠僵菌對近百種農業(yè)害蟲進行室內防治效果評價，對多種昆蟲進行了田間防治試驗，已發(fā)展成為僅次于白僵菌的真菌殺蟲劑.在國外，英國研制的殺蝗綠僵菌生物農藥，防治效果達到90%以上；美國綠僵菌產品用于防治蟑螂、白蟻；巴西和委內瑞拉的綠僵菌產品防治甘蔗沫蟬等.在國內，重慶真菌農藥研制工程中心研制的生物制劑“蝗敵1號”，已在我國北方蝗蟲發(fā)生地區(qū)應用［15］；童樹森等［16］用含孢量2億孢子／mL的綠僵菌粉劑林間噴粉防治青楊天牛，連續(xù)2a防效70%以上；也有學者利用綠僵菌防治椰心葉甲［17］等.對于綠僵菌的研究報道很多，但目前關于在我國北方地區(qū)，從自然感染的桃小食心蟲僵尸上分離病原綠僵菌還未見報道.在國內外，菌種分類也更為科學，已從形態(tài)特征鑒定開始轉向分子手段來確定其種屬地位［18-19］.

傳統的真菌分類鑒定以其形態(tài)學特征、生長特性以及生理生化指標為基礎，但是綠僵菌其生長特性和生理生化指標隨著環(huán)境的變化而不穩(wěn)定，因此本研究在形態(tài)特征鑒定方面，從培養(yǎng)性狀、光學顯微和掃描電鏡的形態(tài)特征相結合分析，相對準確確定了其形態(tài)特征；分子鑒定方面，提取其18S核糖體的DNA-ITS基因序列分析.用不同的技術手段互相佐證，確定了該菌株的種屬地位，鑒定結果更科學.進行毒力檢測時，用不同濃度的孢子懸液來實驗，毒力大小差距大，可以根據生產實踐的需要來確定濃度.桃小食心蟲1a發(fā)生1～3代，在不同寄主上生活史存在一定差異，但基本生活史均為末齡幼蟲入土結繭滯育越冬.第二年幼蟲出土后再結長繭化蛹、羽化，交尾，產卵，孵化幼蟲，幼蟲蛀入果內危害果實，之后出果結繭越冬.我們在果園采集桃小食心蟲時發(fā)現，在越冬后的蟲繭內和土塊中，發(fā)現有自然染病的幼蟲，說明幼蟲在入土的時候已經染菌.因此防治桃小食心蟲可以選擇在幼蟲入土前后，噴灑孢子懸液或者固體菌粉，是最佳防治時期.綠僵菌還需進一步像白僵菌一樣，研究它對靶標害蟲的侵染機理［20］，適應北方干旱低溫的氣候特點［21］，研制應用劑型和野外防治實驗，為開發(fā)利用提供科學依據.

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