晉產(chǎn)北柴胡試管植株的RAPD分析

趙瑒，高可青，郝建平，王梅

（山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

北柴胡（Bupleurum chinense DC.）為傘形科柴胡屬植物，是我國的常用大宗藥材及山西省的道地藥材，《中華人民共和國藥典》收錄其為藥用柴胡的原植物［1］.北柴胡根中含有柴胡皂苷和揮發(fā)油等成分，具有抗病毒、抗細菌內(nèi)毒素、抗炎、抗驚厥、解熱、調(diào)血脂及促進分泌、保肝、提高免疫力等功效［2］.由于過度采掘和自然環(huán)境的惡化致使野生柴胡資源日趨匱乏，柴胡藥材的市場供應(yīng)現(xiàn)在以人工栽培品為主，但人工種植中又普遍存在種質(zhì)混雜、藥材質(zhì)量參差不齊等問題［3］.此外，中藥材質(zhì)量與生態(tài)環(huán)境關(guān)系密切，具有地域特點的品種的嚴重匱乏已經(jīng)成為制約柴胡藥材產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸.種質(zhì)資源鑒定和分類研究是育種的基礎(chǔ).種質(zhì)資源的鑒定傳統(tǒng)上多應(yīng)用形態(tài)標記和生化標記，但效果往往不夠理想.建立在DNA水平上的分子標記技術(shù)的出現(xiàn)，為種質(zhì)資源研究開辟了新的途徑［4-5］，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)在不同種柴胡屬植物間以及北柴胡野生、栽培種中進行了不少分子標記的研究［6-7］.

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是植物種質(zhì)提純復(fù)壯、優(yōu)良種苗快速繁殖以及優(yōu)良種質(zhì)培育的有效手段［8-9］，而選擇遺傳背景清楚、目的產(chǎn)物含量高的優(yōu)良種質(zhì)是上述技術(shù)實用化的基本要求.目前對北柴胡試管植株分子標記的研究鮮有報道.山西省是北柴胡的主要野生資源分布區(qū)和家種品的主產(chǎn)地之一，本實驗選擇9種采自山西不同地區(qū)的北柴胡類型，在快速繁殖的基礎(chǔ)上，從試管苗的葉片中提取DNA并對其進行了RAPD分子標記及聚類分析，進而為北柴胡種質(zhì)資源的初步鑒定和遺傳關(guān)系分析提供分子依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用北柴胡試管快繁植株的類型分別采自山西省9個主要的野生分布區(qū)和人工種植區(qū)（表1，P271）.取繼代培養(yǎng)后的試管植株葉片的中部，經(jīng)ddH2O清洗后用清潔的吸水紙吸干水分備用.

1.2 實驗試劑

隨機擴增引物均購自北京奧科鼎盛生物科技有限公司，TaqDNA聚合酶購自Fermentas公司，β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol）、十六烷基三乙基溴化銨（cetyltrimethylamm-onium bromide，CTAB）、Tris、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、無水乙醇、異戊醇、氯仿和異丙醇等均為國產(chǎn)分析純試劑.

表1 9種晉產(chǎn)北柴胡品種來源Table 1 Source of nine varieties of Bupleurum chinense

1.3 總DNA的提取

DNA提取參照CTAB法［10］，提取的DNA在-20℃保存?zhèn)溆?

1.4 PCR擴增

通過查閱文獻設(shè)計了20個10bp的隨機引物進行PCR擴增.

PCR擴增反應(yīng)在20μL體系中進行，其中含有10×Buffer緩沖液2μL、dNTP 2μL（其中含dATP、dGTP、dTTP、dCTP各200μmol／L）、Mg2＋（25mmol／L）1.5μL、擴增引物（濃度為10μmol／L）1μL、模板DNA稀釋液2μL、Taq聚合酶0.5μL、ddH2O 11μL.

PCR反應(yīng)程序：經(jīng)95℃預(yù)變性5min，然后95℃變性50s，34℃復(fù)性45s，72℃延伸1min，完成35個循環(huán)后，72℃7min補齊，4℃保存.

1.5 RAPD擴增產(chǎn)物檢測

取10μL PCR擴增產(chǎn)物加1μL Loading Buffer，混勻，于含溴化乙錠（EB）的質(zhì)量濃度為2%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測，Marker 2000為參照.

2 結(jié)果與分析

2.1 隨機引物的篩選及擴增圖譜

經(jīng)多次重復(fù)篩選，在20個隨機引物中，有3條引物能夠擴增出清晰、不彌散、重復(fù)性好的條帶.篩選出的引物堿基序列見表2，經(jīng)紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照的電泳擴增圖譜見圖1（P269）.共擴增出22條帶，其中多態(tài)性條帶有18條，多態(tài)百分率為81.8%.

表2 篩選的RAPD引物及序列Table 2 RAPD primers used in genetic diversity analysis and their sequences

2.2 聚類分析

RAPD為顯性標記，同一引物擴增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶被認為具有同源性.為了便于RAPD資料的收集及計算分析，需將RAPD標記分析的結(jié)果（即譜帶）轉(zhuǎn)換成數(shù)字形式.將PCR擴增的DNA電泳條帶作為位點記錄下來，有帶（顯性）、弱帶或強帶均記作“1”，無帶（隱帶）記作“0”.采用SPSS20.0軟件（類間平均鏈鎖法）對所得的二元數(shù)據(jù)進行聚類分析，并繪制樹狀圖.

由圖2（P269）可知，所有種質(zhì)之間均有不同程度的遺傳差異.產(chǎn)自山西平定和盂縣兩地的北柴胡類型聚在一起，然后與產(chǎn)自左權(quán)的類型聚在一起組成類群Ⅰ；產(chǎn)自山西芮城和陽曲兩地的類型聚在一起，然后與產(chǎn)自定襄的類型聚在一起組成類群Ⅱ；產(chǎn)自山西萬榮的類型單獨聚為類群Ⅲ；產(chǎn)自山西夏縣和絳縣兩地的類型聚為類群Ⅳ.

圖1 3條引物在9種北柴胡（表1）中的擴增結(jié)果（a，b，c引物分別為OPC-8、OPD-8和OPE-10）Fig.1 Amplified fragments form nine varieties listed in Table 1of Bupleurum chinense with three RAPD primers（Primers of a，b，c were OPC-8，OPD-8and OPE-10）

圖2 9種北柴胡的RAPD聚類圖Fig.2 Dendrogram of nine varieties of Bupleurum chinense based on the RAPD analysis

3 討論

RAPD技術(shù)是利用隨機引物在生物種群中尋找同源序列、并將同源序列片段擴增出來的分子標記技術(shù).該技術(shù)主要通過DNA帶的有無分析生物種群或個體間的遺傳多樣性和親緣性.由于RAPD技術(shù)具有快速、靈敏，不需要知道被檢基因組序列且對模板質(zhì)量要求不高等特點，在藥用植物系統(tǒng)學(xué)研究中有獨到的優(yōu)勢，它能夠通過不同引物給出整個基因組的多態(tài)性信息，避免了生長環(huán)境和發(fā)育時期不同的影響，并可從DNA水平上進行分類比較分析，確定藥用植物種、品種的親緣關(guān)系［11-12］.

本研究在對產(chǎn)自山西省9個不同地區(qū)的北柴胡類型進行快速繁殖的基礎(chǔ)上，將得到的試管植株作為RAPD分子標記的起始材料.區(qū)別于野生種和栽培種所受的不同外界條件的影響，試管植株起始材料相同、生長環(huán)境一致，遺傳穩(wěn)定性相對更高，保證了RAPD分子標記的重復(fù)性.從聚類結(jié)果來看，9個分別生長、種植于山西不同地區(qū)的北柴胡具有一定程度上的親緣關(guān)系，但相互之間又存在一定的差異.

產(chǎn)自山西萬榮、夏縣和絳縣的3個類型的北柴胡均屬于家種種，其余的6個類型為野生種.通過應(yīng)用RAPD技術(shù)對晉產(chǎn)北柴胡試管植株的基因組DNA進行多態(tài)性擴增，共檢測出22條DNA譜帶，其中多態(tài)性條帶18條（占82%），說明利用3條隨機引物即可將9種晉產(chǎn)北柴胡類型區(qū)分開，應(yīng)用RAPD分子標記技術(shù)進行北柴胡種質(zhì)資源的初步鑒定和遺傳關(guān)系分析是可行的.

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