應(yīng)用ITS序列分析蔥屬植物發(fā)育關(guān)系

田保華，王永勤，裴雁曦＊

（1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，北京 100097）

蔥屬（Allium）種質(zhì)資源十分豐富，多數(shù)人認(rèn)為約有700多種［1］.蔥蒜類蔬菜是蔥屬中以嫩葉或花薹為食用器官的二年生草本植物，包括洋蔥（A.capaL.）、大蒜（A.sativumL.）、細(xì)香蔥（A.schoenoprasumL.）、蔥（A.fistulosumL.）、韭蔥（A.PorrumL.）、胡蔥（A.ascalonicumL.）、薤（A.chinensis G.Don）等［2］.蔥屬的異花授粉特性，以及長(zhǎng)期引種和選育，常出現(xiàn)同名異種或同種異名的問題，加之以往對(duì)蔥屬系統(tǒng)發(fā)育、進(jìn)化及親緣關(guān)系等研究結(jié)果尚存在不少分歧，這給準(zhǔn)確進(jìn)行蔥屬種質(zhì)資源的篩選、鑒定和利用帶來了困難［3-4］.

核糖體核酸（nrDNA）中的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）高度變異性和豐富的種系發(fā)育信息，已證明這一區(qū)域的DNA序列特征可以作為植物系統(tǒng)學(xué)研究的一種良好分子標(biāo)記［5］.隨著相近物種的分化與變異，整個(gè)ITS序列比18S和26S核糖體RNA基因呈現(xiàn)出相當(dāng)大的種內(nèi)差異［6-7］.因而，核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列分析可以被廣泛地用于植物屬內(nèi)、近緣屬間的系統(tǒng)發(fā)育分析.而在蔥屬物種之間，包含5.8SrDNA和側(cè)翼內(nèi)部轉(zhuǎn)錄區(qū)1和2（ITS-1、ITS-2）的ITS序列已經(jīng)成功地用來作為研究種間親緣關(guān)系的特征［8-9］.本研究對(duì)蔥屬14個(gè)不同品種進(jìn)行ITS區(qū)序列測(cè)定與分析，為探討蔥屬植物的系統(tǒng)演化關(guān)系提供分子證據(jù)，為更好地研究和利用種質(zhì)資源提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料（表1）種植于試驗(yàn)地，4周后取新鮮嫩葉作為試材.

CTAB、飽和酚、Tris、氯仿、異戊醇、無水乙醇、異丙醇等均購(gòu)自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；Taq DNA酶、dNTPs購(gòu)自TaKaRa公司.

1.2 目的片段的PCR擴(kuò)增

采用改良的CTAB法［10］進(jìn)行試材基因組DNA的提取，DNA濃度和純度分別用分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行檢測(cè).采用 White等［11］設(shè)計(jì)的ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，對(duì)核糖體DNA的ITS片段擴(kuò)增，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司（Sangon）合成.

表1 蔥屬不同蔬菜品種材料的來源Table 1 Origns of different vegetable materials in Allium

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：模板DNA 2μL、10×PCR buffer（mg2＋Plus）5μL、2.5mmol／L dNTPs 4.5μL、0.1mmol／L引物2μL、1.25UTaq DNA聚合酶，加ddH2O補(bǔ)足50μL.PCR反應(yīng)條件［12］：94℃預(yù)變性1 min；94℃ 變性1min，50℃退火1min，72℃ 延伸2min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃ 延伸5min，4℃保存.

1.3 測(cè)序與數(shù)據(jù)分析

擴(kuò)增出目的片段直接由北京市奧科生物技術(shù)公司進(jìn)行純化與測(cè)序.在NCBI（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST／）上將測(cè)得序列進(jìn)行核苷酸Blast相似性搜索，確證為目標(biāo)序列.參照洋蔥（AJ411944.1）和大蔥（FJ664288.1）的ITS序列確定測(cè)序樣品ITS序列中5.8SrRNA和ITS1和ITS2的界線.用Clustal X 1.8（ftp：／／ftp-igbmc.u-strasbg.fr／pub／ClustalX／）對(duì)目的片段進(jìn)行比對(duì)，通過測(cè)序圖進(jìn)行變異位點(diǎn)的確認(rèn)，并適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行人工調(diào)整.用 MEGA最大簡(jiǎn)約法（Maximum Parsimony，MP）和鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)樹，缺隙（gap）作缺失狀態(tài)，并用Bootstraping法進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)1000次.

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

從14種材料中用ITS1和ITS4擴(kuò)增整個(gè)ITS區(qū)域（ITS1-5.8S-ITS2）后，所有擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)出大小一致的單一條帶約700bp（圖1）；洋蔥×大蔥、大蔥×洋蔥和樓蔥盡管擴(kuò)增的ITS的目的條帶為單一的條帶，但測(cè)序結(jié)果卻顯示為兩個(gè)不同的序列，分別命名為洋蔥×大蔥A和B、大蔥×洋蔥A和B以及樓蔥A和B.

圖1 蔥屬不同種ITS的擴(kuò)增Fig.1 ITS amplification of different species in AlliumL.M.DL1200molecular weight marker

2.2 不同物種序列分析

本試驗(yàn)測(cè)得14種材料ITS（含5.8S）序列的長(zhǎng)度范圍626bp～645bp范圍內(nèi)，樓蔥B的ITS序列最短，為626bp，韭菜的ITS序列最長(zhǎng)，為645bp，各物種的ITS序列平均長(zhǎng)度為640.2bp.除興化香蔥5.8S rDNA序列為162bp外，其中5.8SrDNA序列的堿基長(zhǎng)度均為164bp，平均長(zhǎng)度為163.9bp；各蔥屬物種的ITS1序列的長(zhǎng)度介于232bp～241bp之間，大蔥×洋蔥-A最短，為232bp；韭菜最長(zhǎng)，為241bp；平均為235.1bp；而ITS2序列的長(zhǎng)度介于229bp～244bp之間，樓蔥A、B最短，為229bp，洋蔥×大蔥-A、洋蔥×大蔥-B、大蔥×洋蔥A、大蔥×洋蔥B、阿爾泰蔥、雞腿蔥、興化香蔥和章丘大蔥均為244bp，平均為241.3 bp.各物種的GC含量存在一定的差異，最小的是韭菜，為44.7%；最大的是大蔥×洋蔥-B，為49.6%，兩者相差4.9個(gè)百分點(diǎn)，各物種的ITS序列GC含量平均為47.1%.

當(dāng)空位作缺失處理時(shí)，ITS區(qū)全序列排序后的長(zhǎng)度為653個(gè)位點(diǎn)，變異位點(diǎn)377個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)197個(gè)，分別占57.7%和30.2%；單堿基變異位點(diǎn)180個(gè)，占27.5%；轉(zhuǎn)換和顛換比為0.995.其中，ITS1區(qū)排序后長(zhǎng)度為244個(gè)位點(diǎn)，變異位點(diǎn)149個(gè)，占61.1%，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)78，占32.0%，單堿基變異位點(diǎn)67個(gè)，占27.5%.5.8SrDNA區(qū)排序后長(zhǎng)度為164個(gè)位點(diǎn)，變異位點(diǎn)82個(gè)，占50%，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)36個(gè)，占22.0%，單堿基變異位點(diǎn)46個(gè)，占28%.ITS2區(qū)排序后長(zhǎng)度為245位點(diǎn)，變異位點(diǎn)146個(gè)，占59.6%，信息位點(diǎn)83，占33.9%，單堿基變異位點(diǎn)63個(gè)，占25.7%（表2）.由此位點(diǎn)數(shù)差異統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，ITS序列比5.8SrDNA序列變異程度高，ITS1序列比ITS2序列變異豐富.

表2 ITS序列變異情況Table 2 Variation of ITS squence

2.3 遺傳距離分析與分子進(jìn)化樹的構(gòu)建

圖2 14份蔥屬物種ITS序列系統(tǒng)聚類圖a.最大簡(jiǎn)約法MP分子進(jìn)化樹；b.鄰接法NJ分子進(jìn)化樹樹上各分支上的數(shù)字表示1000次重復(fù)Bootstrap抽樣檢驗(yàn)自展支持率（length＝548；consistency index為0.744118），retention index為0.728125，composite index為0.612529Fig.2 Dendrogram of clustering analysis on ITS sequence result of 14Allium varieties accessions

利用MEGA5軟件Tajima-Nei model計(jì)算出蔥屬14個(gè)種兩兩種間的遺傳距離（D）為0.000～0.383（表3，P264）.其中，胡蔥與洋蔥、分蘗洋蔥種間的遺傳距離為0.000，大蔥與雞腿蔥之間的遺傳距離也為0.000；興化香蔥與韭菜、韭蔥的遺傳距離最遠(yuǎn)都是0.383.大蔥與洋蔥×大蔥A、大蔥×洋蔥A、洋蔥×大蔥B和大蔥×洋蔥B遺傳距離分別為0.039、0.042、0.139和0.119.洋蔥與洋蔥×大蔥A、大蔥×洋蔥A、洋蔥×大蔥B和大蔥×洋蔥B的遺傳距離分別為0.058、0.058、0.157和0.137.洋蔥×大蔥A和洋蔥×大蔥B遺傳距離為0.185；大蔥×洋蔥A和大蔥×洋蔥B的遺傳距離為0.167.洋蔥×大蔥A和大蔥×洋蔥A遺傳距離為0.04；洋蔥×大蔥B和大蔥×洋蔥B遺傳距離為0.079.樓蔥A與B之間遺傳距離為0.148.

利用最大簡(jiǎn)約法（Maximum Parsimony，MP）和鄰位相連法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建的ITS序列的分子進(jìn)化樹具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（圖2，P263）.獲得的最大簡(jiǎn)約樹的步長(zhǎng)為548；一致性指數(shù)（consistency index，CI）為0.744118，保持指數(shù)（retention index，RI）為0.728125，composite index為0.612529.蔥屬14份材料形成兩分支.分支Ⅰ（cladeⅠ）由薤、大蒜、韭蔥、韭菜組成.在此分支又分為三支，一支為韭菜，一支為薤，另一分支又分為兩支，一支為韭菜，另一支為韭蔥，自展支持率為100%.分支Ⅱ（cladeⅡ）由其余的10個(gè)蔥屬材料組成，自展支持率為99%.在此分支又分為兩個(gè)分支.A分支又分為兩支，一支為樓蔥A，另一分支為樓蔥B，自展支持率為85%.B分支又分四個(gè)分支，分別為a、b、c和d；自展支持率為65%.a分支由洋蔥×大蔥A、大蔥×洋蔥A、阿爾泰蔥以及大蔥和雞腿蔥，自展支持率為86%；b分支由洋蔥×大蔥B、大蔥×洋蔥B組成，自展支持率為99%；c分支為興化香蔥；d分支由洋蔥、分蘗洋蔥和胡蔥組成，自展支持率為100%.

3 討論

關(guān)于蔥的起源有多種不同假說.由于大蔥和阿爾泰蔥兩個(gè)種之間的形態(tài)非常相似，而且在南西伯利亞和蒙古共有，阿爾泰蔥被認(rèn)為是大蔥親緣關(guān)系最近的野生近緣種［13］；這兩個(gè)種之間容易雜交，而且雜種表現(xiàn)出很高的花粉和種子生育率［14］；阿爾泰蔥和大蔥的核型非常相似［15］；RAPD分析、葉綠體DNA分析、ITS序列分析顯示，大蔥是單系起源，西伯利亞和蒙古的阿爾泰蔥被認(rèn)為是大蔥野生祖先［16-17］.Havey［4］對(duì)蔥屬植物母系系統(tǒng)發(fā)育研究，結(jié)果顯示阿爾泰蔥與除大蔥外的洋蔥等為并系；相反的利用RFLP技術(shù)分析基因組DNA，結(jié)果顯示與大蔥為并系［18］；Van Raamsdonk等［19］利用RAPD技術(shù)分析，結(jié)果顯示大蔥與阿爾泰蔥為并系.本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)大蔥的兩個(gè)變種雞腿蔥和章丘大蔥與阿爾泰蔥親緣關(guān)系最近，我們的研究結(jié)果支持大蔥起源于阿爾泰蔥的假說.

胡蔥在我國(guó)的邦名比較混亂，學(xué)名可能具有一些爭(zhēng)議，依《Flora of China》［20］認(rèn)為應(yīng)采Allium cepavar.aggregatumG.Don，而非廣泛被使用的Allium ascalonicumL..胡蔥與洋蔥、蔥的親緣關(guān)系不清.從性狀比較的角度，胡蔥的植物學(xué)特征和生物學(xué)特性介于洋蔥和蔥之間；胡蔥雄性完全不育，不能結(jié)子，授以大蔥花粉也不結(jié)子，授以洋蔥花粉可以結(jié)子［21］；利用同功酶［22］及RAPD技術(shù)［23］，結(jié)果顯示胡蔥與洋蔥的親緣關(guān)系比胡蔥與大蔥的親緣關(guān)系更近，并推測(cè)胡蔥可能是大蔥和洋蔥的雜交后代逐漸進(jìn)化而來的.但本研究及孟祥棟等［24］的研究中，大蔥和洋蔥雜種并沒有和胡蔥聚為一類.本研究結(jié)果不支持“胡蔥可能是洋蔥與大蔥的雜交后代逐漸進(jìn)化來的”這一觀點(diǎn).因此，根據(jù)這些結(jié)果，初步推斷胡蔥應(yīng)該是洋蔥的一個(gè)變種或由洋蔥進(jìn)化來的.

表3 不同序列之間進(jìn)化趨勢(shì)評(píng)估Table 3 Estimates of Evolutionary Divergence between Sequences

續(xù)表3 不同序列之間進(jìn)化趨勢(shì)評(píng)估Continue Table 3 Estimates of Evolutionary Divergence between Sequences

樓蔥又名頂球洋蔥，是洋蔥的一個(gè)變種.通常不開花結(jié)實(shí)，僅在花莖上形成七八個(gè)至十余個(gè)氣生小鱗莖，可供繁殖，也可供食用.我們的研究結(jié)果顯示，樓蔥具有兩個(gè)不同的ITS序列，而且兩條序列之間的差異較大.因此，推測(cè)樓蔥為蔥屬間植物雜交起源.為證明此結(jié)果，本研究對(duì)大蔥與洋蔥的正反交的ITS序列進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)雜種一代中存在兩條不同的ITS序列.該結(jié)果更進(jìn)一步證明樓蔥為不同蔥屬植物雜交起源.高秀云根據(jù)核型分析結(jié)果，認(rèn)為該蔥是洋蔥的變種，而不是大蔥的變種；樓蔥染色體數(shù)則為2n＝3x＝24，為三倍體［25］.由此推測(cè)樓蔥為不同蔥屬植物雜交起源的異源三倍體植物.

蔥屬在進(jìn)化上存在兩個(gè)方向，分別形成了管狀葉和扁平葉兩種類型.蔥屬栽培種分為兩大類：一類包括大蔥、細(xì)香蔥、分蔥、洋蔥等，其共同特點(diǎn)是管狀葉，中空；另一類包括韭蔥、大蒜、韭菜等，葉扁平帶狀.本研究結(jié)果支持這一觀點(diǎn).

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