腺病毒介導(dǎo)的BmK CT基因抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞遷移及誘導(dǎo)凋亡的研究

杜軍，付月君，張超，胡濤，梁愛華＊

（1.山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006；2.中國(guó)科學(xué)院 生物物理研究所，北京 100101；3.山西省人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，山西 太原 030006）

氯離子通道神經(jīng)毒素（Chlorotoxin，Cltx，CTX）因來(lái)源于以色列蝎（Leiurus quinquestriatus）尾腺的毒素并能特異地結(jié)合在膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面，從而阻斷氯離子通道而得名［1-3］.該毒素可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞高表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2），進(jìn)一步抑制細(xì)胞的遷移能力［4］.在廣泛分布于我國(guó)的東亞鉗蝎（Buthus martensii Karshch，BmK）中發(fā)現(xiàn)的一種類氯毒素基因［5-6］編碼的多肽與以色列蝎氯毒素有68%的同源性而且有類似的功能［7-8］.東亞鉗蝎氯毒素（BmK CT）在大鼠腫瘤模型中可以抑制腫瘤的遷移和增殖，利用放射性同位素131I標(biāo)記和熒光Cy5.5標(biāo)記的東亞鉗蝎氯毒素蛋白能準(zhǔn)確地診斷體內(nèi)腫瘤位置［9］，為臨床診斷和治療提供了便利［10］.為了使BmK CT蛋白能穩(wěn)定持續(xù)地在體內(nèi)表達(dá)并進(jìn)一步探討在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用機(jī)理，本研究利用腺病毒載體介導(dǎo)BmK CT基因轉(zhuǎn)染人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251細(xì)胞，觀察細(xì)胞遷移及凋亡的情況，并探討可能的凋亡機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 材料

攜帶BmK CT基因和綠色熒光蛋白（GFP）基因的重組腺病毒Ad-BmK CT由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建，帶有綠色熒光蛋白（GFP）基因的腺病毒空載體Ad由湖北鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院十堰市人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所王家寧教授饋贈(zèng)；U251細(xì)胞株由山西省人民醫(yī)院胡濤博士饋贈(zèng)；小牛血清和細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM購(gòu)自Gibco公司、凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche公司、β-actin單克隆抗體購(gòu)自百奇生物公司；caspase-3和細(xì)胞色素C單克隆抗體以及caspase-8和9多克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling公司.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

U251細(xì)胞和AD293細(xì)胞用含體積濃度為10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)BmK CT表達(dá)

重組腺病毒Ad-BmK CT和Ad在AD293細(xì)胞擴(kuò)增過(guò)程中，胰酶消化取部分細(xì)胞1500r／min離心5 min收集，預(yù)冷的無(wú)菌磷酸緩沖液（PBS）漂洗1次，按照RNAisoTMPlus（寶生物公司，Takara）試劑說(shuō)明書，提取總RNA，參考PrimeScript RT reagent Kit（寶生物公司，Takara）說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄cDNA，用BmK CT引物進(jìn)行PCR檢測(cè).

1.2.3 最佳感染濃度測(cè)定

將 Ad-BmK CT及對(duì)照組Ad按1∶1000，1∶2000，1∶5000，1∶10000，1∶20000比例稀釋感染U251細(xì)胞48h后，通過(guò)熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀分析感染效率，GFP細(xì)胞陽(yáng)性率和平均熒光強(qiáng)度一致的為最佳感染濃度.

1.2.4 Boyden Chamber實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞遷移能力

將5μm聚碳酸酯膜固定于24孔板中做Transwell小室.用1mL含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜，取出聚碳酸酯膜用無(wú)菌磷酸緩沖液（PBS）漂洗2次.將PBS、Ad或Ad-BmK CT感染處理48h的U251細(xì)胞消化重懸到無(wú)血清的DMEM中，細(xì)胞數(shù)為1.5×105個(gè)／mL，取100μL加到Transwell小室的上室中，下室加入600μL含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基.在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h后取出上室，棄去培養(yǎng)基，用棉球輕輕擦拭小室里面除去未遷移的細(xì)胞，然后用質(zhì)量百分比濃度為4%的多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，水洗到?jīng)]有背景色.顯微鏡下觀察計(jì)數(shù).

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

將預(yù)先處理的感染Ad或Ad-BmK CT病毒48h的U251細(xì)胞消化重懸，相同劑量的PBS處理組作為對(duì)照，按6×105個(gè)細(xì)胞／孔鋪24孔板，細(xì)胞培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng).用200μL槍頭尖在每孔按“井”字做垂直劃痕，用PBS漂洗3次去掉漂浮細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng).分別在0h、24h、48h取相同位置拍照.

1.2.6 MTT法分析細(xì)胞增殖能力

MTT全稱為3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，常被用作檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)能力.其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，而死亡細(xì)胞無(wú)此功能.將U251細(xì)胞以5000個(gè)／孔的密度接種96孔板，過(guò)夜培養(yǎng).分別按最佳感染濃度加入Ad-BmK CT或Ad，設(shè)PBS為對(duì)照組，每組7個(gè)復(fù)孔.在腺病毒感染24、48、72、96h后每孔加5mg／mL MTT 10μL，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4h后棄去上清，每孔加入100μL二甲基亞砜（DMSO），緩慢震蕩待藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚全部溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)A490值.

1.2.7 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡

將感染Ad或Ad-BmK CT病毒48、72、96h的U251細(xì)胞消化收集，用Annexin V結(jié)合緩沖液漂洗1次，收集細(xì)胞加入100μL Annexin V結(jié)合緩沖液重懸，然后加入0.5μg Annexin V-Cy5和5μL PI，輕輕混勻，室溫避光15min，額外加入400μL Annexin V結(jié)合緩沖液流式細(xì)胞儀檢測(cè).

1.2.8 Western-blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白

正常培養(yǎng)的U251細(xì)胞作為對(duì)照組.Ad及Ad-BmK CT感染U251細(xì)胞48h后，收集細(xì)胞，PBS洗2次，加入RIPA裂解液，360°旋轉(zhuǎn)儀4℃裂解30min.4℃，13000r／min離心15min，取上清加入上樣緩沖液95℃煮沸10min.SDS-PAGE電泳，冰浴轉(zhuǎn)膜，用質(zhì)量百分比濃度為5%的脫脂奶粉封閉1h，按適當(dāng)比例稀釋一抗4℃孵育過(guò)夜，含有體積濃度0.5%的吐溫-20tris緩沖液（TBST）漂洗3次，加入對(duì)應(yīng)的二抗室溫孵育1h，TBST漂洗3次，用ECL顯色液顯色，分子成像系統(tǒng)掃描儀記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS軟件處理數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001）.

2 結(jié)果

2.1 BmK CT在AD293細(xì)胞中的表達(dá)

Ad-BmK CT在AD293細(xì)胞擴(kuò)增過(guò)程中收集細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示Ad-BmK CT擴(kuò)增組在AD293細(xì)胞中有BmK CT表達(dá)，對(duì)照組Ad空載體沒有條帶出現(xiàn)（圖1）.

圖1 BmK CT在AD293細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression of BmK CT in AD293cells

2.2 腺病毒在U251細(xì)胞中的最佳感染濃度

Ad和Ad-BmK CT分別按1∶1000，1∶2000，1∶5000，1∶10000，1∶20000稀釋倍數(shù)感染 U251細(xì)胞，48h后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀分析.結(jié)果表明腺病毒空載體病毒Ad在1∶10000稀釋時(shí)和Ad-BmK CT在1∶1000稀釋時(shí)的GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均＞90%（圖2A）并且平均熒光強(qiáng)度（圖2B）相近.說(shuō)明這兩組的感染效率和蛋白表達(dá)量相近，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選這兩組作為最佳感染濃度.

圖2 Ad和Ad-BmK CT的最佳感染濃度Fig.2 Optimum infection concentration of Ad or Ad-BmK CT

2.3 Ad-BmK CT抑制U251細(xì)胞的遷移

Transwell實(shí)驗(yàn)表明Ad-BmK CT在感染U251細(xì)胞48h后可以抑制細(xì)胞的遷移，從圖3（P256）可以看出，Ad-BmK CT感染組的細(xì)胞數(shù)明顯減少（相對(duì)抑制率＞80%）.劃痕實(shí)驗(yàn)顯示（圖4，P256），Ad-BmK CT組細(xì)胞向劃痕中間遷移明顯減慢或停滯.Ad-BmK CT感染96h后的細(xì)胞狀態(tài)不好并且整體數(shù)目明顯減少.

2.4 Ad-BmK CT抑制U251細(xì)胞存活能力

感染后的U251細(xì)胞經(jīng)MTT法檢測(cè)存活細(xì)胞數(shù).結(jié)果顯示，Ad-BmK CT感染U251細(xì)胞72h、96h后，對(duì)細(xì)胞增殖有明顯的抑制效果（圖5A，P257）.以PBS處理組為參考分析，Ad-BmK CT感染組的細(xì)胞存活能力在72h為70%左右，96h為60%左右（圖5B）.

2.5 Ad-BmK CT誘導(dǎo)U251細(xì)胞的凋亡

熒光顯微鏡觀察顯示，Ad-BmK CT感染72h后細(xì)胞開始出現(xiàn)病變漂浮，96h后變圓漂浮的細(xì)胞更多（圖6A，P258）.利用Annexin V標(biāo)記磷脂酰絲氨酸，PI標(biāo)記核酸流式細(xì)胞儀分析Ad-BmK CT感染U251細(xì)胞48h、72h、96h后的細(xì)胞凋亡情況（圖6B）.統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，與MTT試驗(yàn)結(jié)果相一致，Ad-BmK CT感染組在72h凋亡率為35%左右，在96h凋亡率為45%左右（圖6B，C）.

圖3 Transwell試驗(yàn)分析細(xì)胞遷移能力Fig.3 Transwell assay on the migration of cells

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞遷移能力Fig.4 Wound healing assay on migration of cells

2.6 Western-blot分析凋亡相關(guān)蛋白

Ad-BmK CT和Ad感染組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有明顯的細(xì)胞色素C的釋放（圖7A，P259），caspase-9的前體蛋白表達(dá)量升高，而Ad-BmK CT感染組caspase-3的前體蛋白表達(dá)量更高（圖7B），灰度值比較分析顯示Ad-BmK CT感染組比Ad感染組caspase-3蛋白量顯著升高（圖7C）.

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤在腦內(nèi)呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，其增殖復(fù)發(fā)能力較強(qiáng)等特點(diǎn)是臨床治療的難點(diǎn).BmK CT蛋白在大鼠膠質(zhì)瘤模型上能夠明顯地抑制腫瘤的增殖和遷移［9］；并且可以通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶 MMP-2的活性［7-8］來(lái)限制膠質(zhì)瘤的浸潤(rùn)性生長(zhǎng).目前已有不少關(guān)于腺病毒載體在治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤方面的研究報(bào)道，例如腺病毒載體介導(dǎo)單純皰疹病毒胸苷激酶基因（HSV-tk）、p53基因以及生長(zhǎng)抑制因子基因（ING4）［1，11-13］等對(duì)膠質(zhì)瘤治療的研究.腺病毒載體的主要優(yōu)勢(shì)是在包裝細(xì)胞中能獲得較高的病毒滴度，能感染分裂期和非分裂期的細(xì)胞.腺病毒載體因?yàn)槠渚哂修D(zhuǎn)移效率高、感染細(xì)胞譜廣、病毒滴度高和安全性好的優(yōu)點(diǎn)，是基因疫苗、基因治療、組織工程等研究中重要的轉(zhuǎn)基因病毒載體［14-15］.

先前研究表明，重組東亞鉗蝎氯毒素BmK CT蛋白對(duì)人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞有明顯地抑制增殖和遷移作用［7］，在大鼠腫瘤模型中可以抑制腫瘤的遷移和增殖［9］，然而重組BmK CT表達(dá)量偏低限制了對(duì)該毒素的進(jìn)一步應(yīng)用.本研究利用腺病毒載體介導(dǎo)BmK CT基因轉(zhuǎn)染人的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251，使得BmK CT蛋白在膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)，在病毒感染初期引起部分感染細(xì)胞壞死［16］使BmK CT蛋白釋放出來(lái)與胞外的MMP-2的結(jié)合抑制其活性從而限制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移.另一方面，MMP-2是膜蛋白，經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體途徑表達(dá)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜表面，細(xì)胞內(nèi)的BmK CT蛋白可以與MMP-2前體結(jié)合，在MMP-2還未輸送到細(xì)胞膜上之前與之結(jié)合而發(fā)揮作用.

哺乳動(dòng)物中，經(jīng)典的細(xì)胞凋亡有兩條途徑，一條是死亡受體介導(dǎo)的外源性途徑，一條是由線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑.死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑主要是激活caspase-8的前體蛋白，進(jìn)而激活下游的效應(yīng)子caspase-3，6和7引起細(xì)胞凋亡［17］，本研究分析檢測(cè)沒有caspase-8的表達(dá)（結(jié)果沒有顯示）.線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑主要是細(xì)胞色素C釋放出來(lái)與Apaf1結(jié)合，形成凋亡體復(fù)合物，活化caspase-9的前體蛋白，激活caspase-3，誘發(fā)細(xì)胞凋亡［18］.

本研究結(jié)果顯示，腺病毒載體介導(dǎo)BmK CT可以明顯抑制人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的遷移.Ad-BmK CT感染的U251細(xì)胞在72h有顯著的凋亡率出現(xiàn)，Western-blot分析相關(guān)凋亡蛋白結(jié)果提示，Ad-BmK CT誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是線粒體細(xì)胞色素C的釋放激活了細(xì)胞凋亡途徑.確切的細(xì)胞凋亡機(jī)制尚需進(jìn)一步研究證實(shí)，在這方面的深入研究將為探討B(tài)mK CT基因治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的新途徑和方法提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).

圖6 Ad-BmK CT誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡Fig.6 Ad-BmK CT induce apoptosis of U251cells

圖7 Western-blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Fig.7 Western-blot analysis of apoptosis-related proteins

［1］Badie B，Drazan K E，Kramar M H，et al.Adenovirus-mediated p53Gene Delivery Inhibits 9LGlioma Growth in Rats［J］.Neurol Res，1995，17（3）：209-216.

［2］Olsen M L，Schade S，Lyons S A，et al.Expression of Voltage-gated Chloride Channels in Human Glioma Cells［J］.J Neurosci，2003，23（13）：5572-5582.

［3］Veiseh M，Gabikian P，Bahrami S B，et al.Tumor Paint：a Chlorotoxin：Cy5.5Bioconjugate for Intraoperative Visualization of Cancer Foci［J］.Cancer Res，2007，67（14）：6882-6888.

［4］Deshane J，Garner C C，Sontheimer H.Chlorotoxin Inhibits Glioma Cell Invasion Via Matrix Metalloproteinase-2［J］.J Biol Chem，2003，278（6）：4135-4144.

［5］Zeng X C，Li W X，Zhu S Y，et al.Cloning and Characterization of a cDNA Sequence Encoding the Precursor of a Chlorotoxin-like Peptide from the Chinese Scorpion Buthus Martensii Karsch［J］.Toxicon，2000，38（8）：1009-1014.

［6］Wu J J，Dai L，Lan Z D，et al.The Gene Cloning and Sequencing of Bm-12，a Chlorotoxin-like Peptide from the Scorpion Buthus Martensi Karsch［J］.Toxicon，2000，38（5）：661-668.

［7］Fu Y J，Yin L T，Liang A H，et al.Therapeutic Potential of Chlorotoxin-like Neurotoxin from the Chinese Scorpion for Human Gliomas［J］.Neurosci Lett，2007，412（1）：62-67.

［8］Fu Y J，An N，Chan K G，et al.A Model of BmK CT in Inhibiting Glioma Cell Migration Via Matrix Metalloproteinase-2 from Experimental and Molecular Dynamics Simulation Study［J］.Biotechnol Lett，2011，33（7）：1309-1317.

［9］Fan S，Sun Z，Jiang D，et al.BmK CT Toxin Inhibits Glioma Proliferation and Tumor Metastasis［J］.Cancer Lett，2010，291（2）：158-166.

［10］Mamani J B，Malheiros J M，Cardoso E F，et al.In Vivo Magnetic Resonance Imaging Tracking of C6Glioma Cells Labeled with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles［J］.Einstein （Sao Paulo），2012，10（2）：164-170.

［11］Perez-Cruet M J，Trask T W，Chen S H，et al.Adenovirus-mediated Gene Therapy of Experimental Gliomas［J］.J Neurosci Res，1994，39（4）：506-511.

［12］Nashimoto T，Komata T，Kanzawa T，et al.Mild Hyperthermia Plus Adenoviral p53Over-expression Additively Inhibits the Viability of Human Malignant Glioma Cells［J］.Int J Hyperthermia，2005，21（7）：615-629.

［13］湛利平，李巧玉，張炎，等.腺病毒介導(dǎo)的ING4基因抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖遷移的機(jī)制研究［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2011，27（11）：1188-1190.

［14］Burton J B，Johnson M，Sato M，et al.Adenovirus-mediated Gene Expression Imaging to Directly Detect Sentinel Lymph Node Metastasis of Prostate Cancer［J］.Nat Med，2008，14（8）：882-888.

［15］King G D，Muhammad A K，Xiong W，et al.High-capacity Adenovirus Vector-mediated Anti-glioma Gene Therapy in the Presence of Systemic Antiadenovirus Immunity［J］.J Virol，2008，82（9）：4680-4684.

［16］Miao E A，Rajan J V，Aderem A.Caspase-1-induced Pyroptotic Cell Death［J］.Immunol Rev，2011，243（1）：206-214.

［17］Stennicke H R，Salvesen G S.Caspase Assays［J］.Methods Enzymol，2000，322：91-100.

［18］Eskes R，Desagher S，Antonsson B，et al.Bid Induces the Oligomerization and Insertion of Bax into the Outer Mitochondrial Membrane［J］.Mol Cell Biol，2000，20（3）：929-935.