組合樹脂技術(shù)純化葛根中葛根素工藝研究*

劉金平，湯樹良，袁 航，鄭志剛，劉長(zhǎng)青

(1.江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司，淮安 223002;2.天津天士力集團(tuán)，天津 300402;3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100029)

野葛［Pueraria Lobata(Willd)Ohwi］根中富含葛根素，是一種異黃酮類化合物，具有降低心肌耗氧量、改善局部微循環(huán)障礙等多種藥理作用［1］。近年來(lái)，鑒于葛根素治療心血管疾病的療效較好，高純度的葛根素提取物市場(chǎng)需求急劇上升。大孔吸附近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取分離［2，3］。目前僅有李君劍等［4］采用AB－8型大孔吸附樹脂純化得葛根素純度為25%的提取物，未看到葛根素純度更高的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用組合樹脂技術(shù)對(duì)葛根藥材進(jìn)行了研究，較好地實(shí)現(xiàn)了高純度葛根素提取物的簡(jiǎn)捷產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，并為組合樹脂技術(shù)在工業(yè)化大生產(chǎn)方面的應(yīng)用開創(chuàng)先例及奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters Alliance高效液相色譜儀，包括2695 Separations Module四元泵、在線真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱，Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器，Empower色譜工作站，BüCHI Rotavapor R－200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BüCHI公司)。

1.2 試劑與樣品 預(yù)制硅膠H板(青島海洋化工廠分廠);乙腈(美國(guó)Fisher公司)為色譜純，甲醇、乙酸乙酯、正丁醇(北京化工廠)和乙酸(北京化學(xué)試劑公司)均為分析純，水為重蒸餾水;葛根素對(duì)照品(批號(hào)110752－200209，中國(guó)藥品生物制品檢定所);實(shí)驗(yàn)中所用的藥材來(lái)自陜西商洛藥源基地。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［5］HPLC色譜柱:Kromasil C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇 － 水(25∶75);流速:1.0 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):250 nm;進(jìn)樣量:5 μl;柱溫:30℃。在此條件下葛根素保留時(shí)間約在14 min。TLC展開劑:三氯甲烷 －甲醇 －水(7∶2.5∶0.25)，紫外燈365 nm下檢視。

2.2 葛根素對(duì)照品溶液的制備 精密稱取葛根素對(duì)照品適量，加甲醇制成0.0418 mg/ml的葛根素對(duì)照品溶液。

2.3 葛根素提取物制備工藝路線，見(jiàn)圖1。

圖1 葛根素提取物制備工藝路線

2.4 試驗(yàn)結(jié)果 分別以20、40、48、50和50 kg葛根藥材，按工藝路線進(jìn)行了5批試驗(yàn)，得提取物，各精密稱取5.0 mg提取物粉末于50 ml量瓶中以甲醇定容，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，續(xù)濾液作為供試品溶液。在上述色譜條件下分析，結(jié)果表明該工藝路線穩(wěn)定、可靠，可進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，見(jiàn)表1。

表1 5批提取物中葛根素含量檢測(cè)結(jié)果

3 討論

3.1 工藝用樹脂及水解條件的考查

3.1.1 第一步樹脂篩選考查 對(duì) AB－8、D－392、S－8、D －390、D －4020、H －103、NKA、NKA －9 和K－5九種樹脂進(jìn)行篩選，稱取500 g粉碎葛根藥材，按工藝路線提取得提取液。將提取液分成九等份，分別過(guò)九種樹脂裝填柱(ф 3 cm×40 cm)，柱體積約150 ml;收集過(guò)柱液，再以3倍體積水洗脫;從大工業(yè)化生產(chǎn)的簡(jiǎn)捷、快速、成本低廉方面考慮，采用藥典薄層方法監(jiān)測(cè)過(guò)柱液和水洗液。結(jié)果表明，同等條件下D－392、D－390、S－8三種樹脂能較好吸附有效成分葛根素。見(jiàn)表2。

表2 薄層色譜法對(duì)大孔樹脂洗脫液監(jiān)測(cè)結(jié)果

3.1.2 樹脂容量的選擇——葛根素泄漏實(shí)驗(yàn)研究稱取200 g粉碎葛根藥材，按工藝路線提取得提取液，將提取液均分為三等份。同上方法對(duì)D－392、D－390、S－8三種樹脂裝柱進(jìn)行篩選，再以HPLC監(jiān)測(cè)其泄漏情況。以流出液中葛根素濃度為縱坐標(biāo)，流出體積為橫坐標(biāo)作圖，得泄漏曲線。結(jié)合三張泄漏曲線圖，并考慮樹脂的再生難易及對(duì)溶劑洗脫能力以及藥材與樹脂比，從中選擇了D－392大孔吸附樹脂，見(jiàn)圖2。多批50 g粉碎的葛根藥材按工藝路線經(jīng)第一步樹脂純化得提取物，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下分析，所得色譜圖見(jiàn)圖3。計(jì)算葛根素提取物純度為20% ～30%。

3.1.3 水解條件考查 查閱大量文獻(xiàn)，鑒于葛根素為碳－糖結(jié)合，采取水解［6］工藝可水解除去以碳－氧－糖連接的類似結(jié)構(gòu)的化合物，提高葛根素提取物的純度。因鹽酸分子小，比較活潑，其催化水解反應(yīng)對(duì)設(shè)備的腐蝕性大，環(huán)境污染嚴(yán)重等，不利于大生產(chǎn);而硫酸分子較大，酸性較強(qiáng)，其催化水解效果好。綜合考慮，選擇硫酸催化。此外，從生產(chǎn)成本、工藝處理工時(shí)及環(huán)保因素考慮，確定1% ～2%(V/V)硫酸液。稱取純度為20% ～30%的葛根素提取物50 g兩份，均加入4倍量的1% ～2%(V/V)硫酸液溶解后分別水解3～4 h和5～6 h，水解液調(diào)近中性，并在水解液的基礎(chǔ)上再稀釋至5倍體積，濾過(guò)得濾液。分別取濾液按《中國(guó)藥典》薄層方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明3～4 h已水解完全。

3.1.4 第二步樹脂考查 將水解后處理后得到的提取物，液相監(jiān)測(cè)其葛根素含量為30% ～40%?？煽闯鏊夂蟾鸶睾刻岣?，但仍有雜質(zhì)影響，需進(jìn)一步篩選樹脂純化。對(duì)AB－8、D－392、S－8三種樹脂進(jìn)行考查，稱取250 g葛根粗提物粉末，按工藝路線提取經(jīng)第一步樹脂純化和水解并處理后得水解液，將水解液均分3等份。分別過(guò)3種樹脂裝填柱(ф 3 cm×40 cm)，柱體積約150 ml;收集過(guò)柱液，再以3倍體積水洗脫;以《中國(guó)藥典》薄層方法監(jiān)測(cè)過(guò)柱液和水洗液。結(jié)果表明，同等條件下D－392、S－8兩種樹脂均能較好吸附有效成分葛根素，見(jiàn)表3。

圖2 葛根藥材提取液

在D－392大孔吸附樹脂的泄漏曲線

圖3 對(duì)照品(A)D－392純化粗提物(B)HPLC色譜圖

表3 薄層色譜法對(duì)大孔樹脂洗脫液的監(jiān)測(cè)結(jié)果

3.1.5 樹脂容量的選擇——葛根素泄漏實(shí)驗(yàn)研究稱取100 g葛根粗提物粉末，同上法處理得水解液，均分2等份。以“3.1.4”項(xiàng)下方法分別過(guò) D －392、S－8兩種樹脂所裝柱進(jìn)行篩選，再以HPLC監(jiān)測(cè)其泄漏情況。以流出液中葛根素濃度為縱坐標(biāo)，流出體積為橫坐標(biāo)作圖，得泄漏曲線。結(jié)合各泄漏曲線圖并考慮樹脂的再生難易及對(duì)溶劑洗脫能力，以及藥材與樹脂比，從中選擇了S－8樹脂富集吸附。見(jiàn)圖4。以多批粗提物進(jìn)行水解再以S－8純化得提取物，計(jì)算得提取物純度均大于55%。

圖4 S－8大孔吸附樹脂對(duì)葛根粗提物水解液的泄漏曲線

3.2 其他

3.2.1 按本工藝路線進(jìn)行葛根藥材提取分離，除了得到約2%收率、葛根素含量55%以上的高純度提取物外，還可以得到約1%收率的大豆異黃酮提取物，但其純度未做進(jìn)一步的考查。

3.2.2 本提取分離純化工藝路線先進(jìn)、簡(jiǎn)捷、周期短，成本低廉，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)。

1 朱慶磊，呂欣然.葛根素的藥理學(xué)和臨床應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.中草藥，1997，28(11):693

2 陳延清.用七種不同大孔吸附樹脂精制樂(lè)脈膠囊的研究［J］.中成藥，2001，23(8):553

3 米靖宇，宋純清.大孔吸附樹脂在中草藥研究中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.中成藥，2001，23(12):914

4 利劍君，李穩(wěn)宏，高新，等.AB－8型大孔吸附樹脂吸附葛根素過(guò)程的研究［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，34(4):78

5 中國(guó)藥典［S］.一部.2010:附錄36

6 潘娓婕，劉謙光.酸水解法從葛根中提取分離葛根素和大豆苷元［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2000，12(6):66