利用果蠅模型研究帕金森病的發(fā)病機制

梁 潔，羅建紅，金靜華 綜述

(浙江大學醫(yī)學院神經(jīng)生物研究所，浙江 杭州 310058)

果蠅作為一種廣泛應用于神經(jīng)科學領域的模式生物，具有很多優(yōu)勢。首先，它成長周期快速(10～14 d)，壽命短暫(50～60 d)。其次，果蠅含有人類疾病相關基因中至少75%同源基因，許多最初在果蠅中鑒定的基因和信號通路，被發(fā)現(xiàn)在人類等許多生物也都是保守的。此外，果蠅的一些細胞生理通路中的核心功能組件也是與人類保守的。相比較以嚙齒類動物作為PD 模型，果蠅①性狀表型豐富。突變類型多，并易于觀察如復眼、體色、翅膀形狀等;②染色體數(shù)目少，其核型只包括4 對同源染色體，其中l(wèi) 對為性染色體;③幼蟲的唾液腺細胞中含有巨大的多線染色體，利用組織化學的特異性染色法可以準確地觀察到DNA 和RNA 在染色體上的變化，便于研究染色體的重復、缺失、倒位和易位的細胞遺傳學特征及其所產(chǎn)生的遺傳學效應等。嚙齒類動物的壽命要比人類的短得多，因而，盡管嚙齒類的這種年齡依賴性的缺點可以通過給予神經(jīng)毒物或多重轉基因的方法來彌補，但是用它們來制作年齡依賴性的疾病模型仍然受到一定的限制。而1988年，研究發(fā)現(xiàn)了果蠅基因組中含有P 轉座子——一段特異的具有轉位特性的獨立的DNA 序列，能夠在基因組內對DNA 進行剪切和粘貼--使果蠅成為退行性疾病研究的理想模型。

利用果蠅研究遺傳性疾病主要是通過三個相互關聯(lián)的方法:①在果蠅中錯義表達人類疾病基因的野生型或突變型;②在果蠅中過表達或敲除與人類疾病基因同源的果蠅基因;③通過基因篩選的方式，確定一些能夠調控1 和2表型的增強或抑制。通過使用GAL4/上游激活序列(UAS)系統(tǒng)能夠實現(xiàn)這三種方法，控制果蠅目的基因時間特異性和組織特異性的表達。

PD 是發(fā)病率僅次于阿爾茲海默病的常見的神經(jīng)退行性疾病之一，60歲以上的人群中有1%～2%的人患有此病。PD 的主要癥狀表現(xiàn)為運動障礙:運動徐緩;肌張力增加導致四肢、頸強直及面部缺乏表情;靜止性震顫和姿勢運動異常?；颊哌€會有一些自主神經(jīng)功能紊亂和認知能力障礙的表現(xiàn)。

PD 主要是由于投射到腦干紋狀體黑質的DA 神經(jīng)元的退變所致，引起小膠質細胞的激活增加及殘存的DA 神經(jīng)元中蛋白聚集體路易小體(Lewy body)的形成。但是迄今為止，導致DA 神經(jīng)元退變的原因仍不十分清楚。目前與家族性PD 有關的基因位點已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了13個，其中鑒定并報道有突變的有6個:α-SYN(PARK1/4)、Parkin (PARK2)、UCHL1(PARK5)、PINK1(PARK6)、DJ-1(PARK7)和LRRK2 (PARK8)。此 外，還 發(fā) 現(xiàn) α-SYN、UCHL1、PINK1 和LRRK2 這4個基因與原發(fā)性PD 有關。

果蠅神經(jīng)系統(tǒng)DA 的合成與人類類似，同時果蠅的DA 系統(tǒng)也參與了運動控制，因此目前普遍認為果蠅DA 神經(jīng)元的死亡導致運動功能障礙與PD 發(fā)病的情況具有可比性，果蠅也是研究PD 的一種理想的模式生物。在果蠅模型中，已經(jīng)在進行著α-SYN(PARK1/4)、Parkin (PARK2)、PINK1 (PARK6)、DJ-1(PARK7)和LRRK2(PARK8)等基因的功能研究。

1 α-Synuclein 在果蠅中的研究

α-Synuclein (α-Syn)是PD 的病理標志路易小體的主要組成成分。α-Syn 基因是家族性PD 的致病基因之一，還會增加散發(fā)性PD 的發(fā)病風險。錯義突變A53T、A30P 及α-Syn 基因組重復等都能引發(fā)常染色體顯性遺傳性PD。關于表達α-Syn 的轉基因動物模型的研究表明，α-Syn 在突觸核蛋白病變的發(fā)病機制中起著關鍵作用。果蠅本身不表達α-Syn，在果蠅神經(jīng)元中過表達人的α-Syn 或突變體A53T、A30P 蛋白，成功重現(xiàn)了人類PD 的幾個特點:①運動器官功能障礙;②路易小體樣包涵體的形成;③隨年齡增加的DA 神經(jīng)元的死亡，而不對其他類型的神經(jīng)元產(chǎn)生影響，因此，這一果蠅PD 模型已經(jīng)廣泛用于由α-Syn 誘導的神經(jīng)退行性疾病的分子發(fā)病機制的研究。

α-Syn 的異常聚集是PD 的主要病理特征之一，其中錯誤折疊的α-Syn 形成聚集體，在PD 發(fā)病中占有重要地位。在果蠅中過表達缺失C 端71～82 位氨基酸(NAC 結構域)的不具備聚集化能力的α-Syn 后，果蠅無明顯DA 神經(jīng)元死亡，而過表達聚集化能力增強的截短形式的α-Syn 后則表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)毒性，進一步實驗證實可能是由于NAC 結構域在α-Syn的解蛋白過程會由鈣蛋白酶-1 介導形成高分子量聚集物——一種B-片狀結構所致。不溶性纖維狀聚集化α-Syn 的形成也與PD 發(fā)病緊密相關。在果蠅神經(jīng)元及DA 神經(jīng)元中過表達纖維狀聚集化α-Syn 后發(fā)現(xiàn)，它并非PD 運動障礙癥狀出現(xiàn)的始因，會引發(fā)異常睡眠，異常節(jié)律周期等非運動型癥狀，這些非運動型癥狀在早期神經(jīng)元功能受損時就已經(jīng)出現(xiàn)。

研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙?；?6(HDAC6)能夠以促進α-Syn 形成包涵體的方式抑制α-Syn 對神經(jīng)元的毒性作用。過表達α-Syn 的果蠅敲除HDAC6 后觀察到α-Syn 引起的DA 神經(jīng)元死亡加劇，HDAC6 突變的果蠅的DA 神經(jīng)元中過表達α-Syn 后相較野生型形成的α-Syn的包涵體變少，提示HDAC6 能夠抑制α-Syn 形成毒性寡聚物，而是形成非毒性的包涵體。另一個被關注的具有保護DA 神經(jīng)元的蛋白質是溶酶體蛋白酶組織蛋白酶D(CathD)，它能夠有效地降解DA 神經(jīng)元中冗余的α-Syn，缺失CathD 會增強α-Syn 的毒性作用。

磷酸化在α-Syn 的寡聚化、纖維化和路易小體的形成中起了非常重要的作用。通過免疫學和生化的方法發(fā)現(xiàn)，PD 發(fā)病相關的磷酸化位點在Ser129、Ser87 和C 端的三個位置(Tyr125、Tyr 133 和Tyr136)。在正常的老化過程中，人和果蠅Tyr125 位點的磷酸化逐漸減少，PD患者的大腦皮層組織幾乎檢測不到Tyr125 磷酸化，提示Tyr125 位點的磷酸化能夠抑制毒性寡聚體的形成。突觸核蛋白病變中Ser87 的磷酸化增強，也能夠抑制α-Syn 的寡聚化，并影響突觸核蛋白與膜蛋白的相互作用。Ser129 的磷酸化會促進α-Syn 的寡聚體的形成。研究提示，PD 發(fā)病相關的α-Syn 的神經(jīng)毒性與Ser87/Tyr125 位點的磷酸化與Ser129 的失衡相關。

α-Syn 的聚集化與分子伴侶也密切相關。過表達α-Syn 的果蠅中過表達hsp70 后能夠改善DA 神經(jīng)元的損傷，但不影響包涵體的形成。。表達hsp70 結構域功能缺失的突變體hsc4.K71S 后，加速了DA 神經(jīng)元的死亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)，hsp90 抑制劑格爾德霉素和熱休克轉錄因子1 的激活劑，也能誘導hsp70 的表達而抑制α-Syn 對神經(jīng)元的毒性作用。

2 Parkin 在果蠅中的研究

Parkin 是parkin 編碼的E3 泛素連接酶，由N 端的泛素樣結構域和C 端的兩個指環(huán)狀結構域組成的，能夠泛素化并降解多種蛋白質，包括CDCrel-1，parkin 相關內皮素受體樣受體(Pael-R)，細胞周期素E，α/β-tubulins，RanBP2，βamyloid 等。Parkin 基因的突變是目前公認的遺傳性帕金森病的最主要原因之一，50%的家族性早發(fā)性PD 和2%～6%的遲發(fā)性PD 的發(fā)病都與之相關。Parkin 的突變包括外顯子缺失，基因重復以及一些錯義突變，最初認為Parkin 只與隱性PD 相關，但后來進一步研究發(fā)現(xiàn)雜合子parkin 增加PD 易感性。

果蠅基因組中包含人類parkin 的同源基因，敲除parkin 的果蠅成蟲表現(xiàn)出明顯的DA神經(jīng)元-特別是前橋背側(protocerebral posterior lateral PPL1)區(qū)神經(jīng)元的死亡，運動能力的損傷，線粒體病變和間接飛行肌的退變，此外其表型還包括壽命縮短、雄性不育、對氧化應激損傷敏感等。在parkin 敲除的果蠅中過表達調控重金屬動態(tài)平衡的金屬應答轉錄因子1 (MTF-1)有解毒作用，能夠顯著的緩解其病理表型，延長了果蠅的壽命，改善了果蠅運動能力，在肌肉細胞水平和線粒體結構也明顯改善，這提示在金屬代謝過程中parkin 與MTF-1 功能上互補，也提示了MTF-1 基因多態(tài)性能影響帕金森病的嚴重程度。在parkin 敲除的果蠅中發(fā)現(xiàn)，當降低真核翻譯起始因子4E (eIF4E)的活性后能緩解parkinP23 突變型的雄性不育表型和一些其他缺陷，進一步降低eIF4E 結合蛋白(4EBP)的水平也有同樣的結果，這支持了parkin 和eIF4E 是在一個共同通路上的觀點。

PD 發(fā)病相關的Parkin 突變體在果蠅中也有明確的表型。果蠅過表達parkin 的突變體R275W 后，也表現(xiàn)出明顯的年齡依賴的PPL1區(qū)DA 神經(jīng)元的退變，運動能力下降，并對魚藤酮引起的氧化應激損傷更敏感，但過表達其另一個突變體G328E 則無明顯改變。過表達另外兩個重要PD 發(fā)病相關的parkin 的突變體Gln311Stop (Q311X)和Thr240Arg(T240R)也有典型的病理特征。在這一PD 模型中研究發(fā)現(xiàn)，過表達或抑制表達調控DA 代謝平衡的囊泡單胺轉運子，對應產(chǎn)生緩解或加劇parkin突變體表達引起的癥狀，提示parkin 影響胞漿內多巴胺代謝特異性針對DA 產(chǎn)生毒性作用。

用RNAi 干擾的方法能夠特異性降低DA神經(jīng)元中parkin 的表達量，但這種干擾效果不足以引起明顯的DA 神經(jīng)元的死亡。研究顯示，parkin 的下游作用物Pael-R 的異常聚集會引起DA 神經(jīng)元的死亡，抑制parkin 的表達水平會加速Pael-R 的毒性作用。

此外，在過表達α-Syn 的果蠅PD 模型中過表達parkin，parkin 能夠抑制α-Syn 對DA 的毒性作用，但沒有明顯影響胞漿的α-Syn 水平，提示了parkin 在PD 發(fā)病中的保護作用。

3 PINK1 在果蠅中的研究

PINK1 是一個定位在線粒體的絲氨酸/蘇氨酸激酶，對氧化應激誘導的細胞凋亡具有保護作用。PINK1 參與細胞呼吸鏈的組成，與絲氨酸蛋白酶HtrA2、parkin 以及分子伴侶Hsp90和CDC37 相互作用。HtrA2 的同源蛋白參與線粒體質量控制體系，但目前對于HtrA2 是否參與PINK1 的降解尚無定論。PINK1 與parkin 相互作用影響PINK1 的泛素化和降解。PINK1 能夠與parkin、DJ-1 形成一個功能性E3連接酶復合物通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)，促進降解錯誤折疊的parkin 底物。同時，PINK1 與Hsp90-CDC37 復合物的相互作用改變全長PINK1 穩(wěn)定性和42 kDa 的裂解產(chǎn)物。UPS 嚴重依賴ATP，而PINK1 功能缺失會降低ATP 水平，UPS 受損，因此積累的錯誤折疊的蛋白質和泛素化蛋白質通過自噬途徑降解。

果蠅PINK1 基因編碼721個氨基酸的多肽與兩個特征性基序:一個線粒體定位基序和一個絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域，與人PINK1類似，激酶結構域與人PINK1 具有60%的相似性(42%完全一致)。果蠅PINK1 與人PINK1同樣是定位于線粒體的。

敲除PINK1 的果蠅會出現(xiàn)雄性不育，肌細胞變性凋亡，線粒體形態(tài)缺陷并增加對應激損傷，包括對氧化應激損傷的敏感性。PINK1 突變體果蠅品系也表現(xiàn)出飛行肌和多巴胺能神經(jīng)元退變導致運動功能障礙，這些病理變化與parkin 突變體的表型非常類似。2006年，研究發(fā)現(xiàn)在PINK1 突變體果蠅中過表達parkin 后，能夠改善其雄性不育肌肉退變等病理表型，反之則無類似效果，而同時突變PINK1 和parkin的表型與單獨突變其中一種的表型一致，提示了PINK1 與parkin 在同一條通路中，且PINK1在parkin 的上游，它們共同調控線粒體動態(tài)和功能。在果蠅神經(jīng)元中的研究顯示，PINK1能夠招募parkin 定位至功能障礙的線粒體上促進其降解。PINK1 和parkin 能夠介導線粒體外膜上線粒體融合蛋白(Mfn)的泛素化，敲除PINK1 或parkin 導致Mfn 含量升高伴隨線粒體伸長，提示Mfn 泛素化可能參與標記晚期受損線粒體并通過自噬降解的過程。

在PINK1 突變果蠅品系中過表達人PINK1能夠挽救病理表型，證明人PINK1 與果蠅PINK1 在功能上的保守性。電鏡下觀察到果蠅Bcl-2 也能夠改善PINK1 突變體的表型。研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制視萎縮基因1 (OPA1)和Mfn的融合線粒體功能，或增強動力蛋白相關蛋白1 (drp1)的線粒體分裂能力，均能改善病理表型，提示PINK1 引起病變與線粒體功能障礙息息相關。

利用RNAi 手段抑制果蠅PINK1 表達后，發(fā)現(xiàn)了一個PINK1 下游參與線粒體分裂作用的底物PGAM5，降低PGAM5 的表達能夠抑制肌肉退變，運動障礙及壽命縮短等表型的發(fā)生，而過表達PGAM5 則加速病變，但PGAM5 對parkin 突變型無影響，提示PGAM5 可能是獨立與parkin 的一條PINK1 的下游途徑。

4 DJ-1 在果蠅中的研究

DJ-1 基因突變引起常染色體隱性PD。DJ-1 基因編碼一個小的二聚體單結構域蛋白，定位于胞漿、細胞核和線粒體上，是ThiJ/PfPI超家族成員，但又屬于一個不同的分支。DJ-1能夠抑制氧化應激損傷，并保護神經(jīng)元被毒素損傷，迄今DJ-1 功能的分子機制仍未明確。

果蠅擁有兩個人DJ-1 的同源基因:DJ-1a和DJ-1b。其中DJ-1a 主要表達在睪丸，而DJ-1b 則廣泛存在于大多數(shù)組織，與人DJ-1 表達模式相類似。

研究發(fā)現(xiàn)，用RNAi 的方法降低全身DJ-1a的表達或通過表達DJ-1b 的突變體抑制DJ-1b的功能，均能導致果蠅對百草枯的毒性更加敏感，壽命縮短，運動功能障礙，但這兩種全身性抑制DJ-1 的果蠅中并未表現(xiàn)出DA 神經(jīng)元的死亡。而特異性抑制DJ-1a 在DA 神經(jīng)元表達的果蠅表現(xiàn)出氧化應激損傷，線粒體功能障礙和年齡依賴的DA 神經(jīng)元死亡，可作為一種果蠅PD 模型檢測神經(jīng)保護性藥物。Fiona 的研究中卻發(fā)現(xiàn)，DJ-1b 的突變體果蠅相較于野生型果蠅表現(xiàn)出DA 神經(jīng)元更高的存活能力。20 日齡和40 日齡的兩種果蠅DA 神經(jīng)元數(shù)量無明顯差別，而到60 日齡DJ-1b 的突變體果蠅DA 神經(jīng)元數(shù)量較野生型更多。這可能是由于DJ-1b 功能缺失導致DJ-1a 代償性表達上調，表明該果蠅的同源DJ-1a 在多DA 神經(jīng)元的存活和氧化應激反應中發(fā)揮關鍵作用。

目前，對DJ-1 的關注主要還是在其對氧化應激損傷的調節(jié)作用方面。給DJ-1b 突變果蠅喂食抗PD 藥物和抗氧化劑后發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑對DJ-1b 突變果蠅的壽命等表型有所改善，同時發(fā)現(xiàn)，果蠅腦中活性氧簇(ROS)的水平升高，過氧化氫酶活性和脂質過氧化水平升高，提示了DJ-1b 對氧化應激損傷的作用。

DJ-1a 和DJ-1b 雙敲除的果蠅對谷胱甘肽(GSH)過氧化物酶抑制物的作用更為敏感，生化的證據(jù)顯示DJ-1 能與RNA 底物有相互作用，包括線粒體基因和GSH 代謝的相關基因，提示GSH 等RNA 底物對DJ-1 的結合也可能是DJ-1 功能的一條通路。

DJ-1a 和DJ-1b 雙敲除的果蠅表現(xiàn)年齡依賴的線粒體功能障礙，其表現(xiàn)型與PINK1，parkin 突變體的表型相似:雄性不育，壽命縮短，運動能力障礙，以及偶聯(lián)線粒體減少，降低ATP 水平。進一步研究發(fā)現(xiàn)，當上調DJ-1 的表達時能夠改善PINK1 突變體的表型，而parkin的則不能。其中果蠅DJ-1 的半胱氨酸C104(類似于人類C106)對DJ-1 的氧化功能至關重要，也提示了在線粒體功能中DJ-1 也在PINK1的下游或與PINK1 平行。

5 LRRK2 在果蠅中的研究

人的富含亮氨酸重復激酶2(LRRK2)的基因突變與家族性和散發(fā)性PD 的發(fā)病相關。LRRK2 屬于ROCO 基因家族，ROCO 基因編碼多個蛋白結構域的大蛋白，包括一個特有的GTP 酶結構域，命名為ROC 和一個功能未知的結構域COR。LRRK2 還含有LRR 和WD40 結構域，在此外還含有一個蛋白激酶域，具有不依賴GTP 的磷酸化活性。在眾多已經(jīng)確定的LRRK2 的突變體中，G2019S和G2385R是最為常見的，其引起發(fā)病的機制是改變蛋白激酶的活性。

果蠅LRRK(CG5483)基因編碼一段含有2 351個氨基酸的多肽，其中包含高度保守的特征性基序，一個LRR 結構域，一個ROC 結構域和一個絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域。這些基序與人LRRK2 的基序分別有38%、46%和44%的相似性，同時LRRK2 在果蠅成蟲腦的表達量很高。

在果蠅感光器中過表達野生型人LRRK2和LRRK2-G2019S 突變體后會引起視網(wǎng)膜退變，在神經(jīng)元中過表達野生型人LRRK2 和LRRK2-G2019S 突變體導致成蟲選擇性DA 神經(jīng)元死亡，運動功能障礙，壽命縮短，表達突變型所引起的癥狀更為顯著。喂食左旋多巴之后果蠅能夠改善運動損傷的狀況，但無法控制TH陽性神經(jīng)元的死亡。

LRRK2 抑制劑GW5074 和索拉非尼能夠改善G2019S-LRRK2 引起的神經(jīng)退行性變，在果蠅中表達一個缺失C 端激酶活性的LRRK2突變體后觀察到未表現(xiàn)出PD 表型，提示增加LRRK2 激酶活性會增加神經(jīng)毒性，抑制激酶活性則能夠降低神經(jīng)毒性的影響。

eIF4E 的結合蛋白(4E-BP)是eIF4E 翻譯的負反饋調節(jié)蛋白，也是各種應激反應的一個重要調控介質。果蠅過表達人LRRK2 和dLRRK2 都能磷酸化4E-BP，對氧化應激損傷更敏感，DA 神經(jīng)元死亡加劇。

LRRK2 能夠直接磷酸化叉頭框轉錄因子(FoxO1)并增強其轉錄活性。FoxO1 參與控制各種細胞過程:細胞周期、細胞死亡、代謝和氧化應激、調節(jié)4E-BP 的轉錄。在果蠅模型中發(fā)現(xiàn)LRRK2 會增強FoxO1 的神經(jīng)毒性，F(xiàn)oxO1 突變后不被LRRK2 的磷酸化從而抑制其神經(jīng)毒性。該結果提示FoxO1 在LRRK2 相關PD 發(fā)病中的重要地位。

此外，有研究提示LRRK2 與Parkin、DJ-1和PINK1 都有相互作用。在LRRK2 相關果蠅PD 模型中過表達Parkin，DJ-1 和PINK1 后對PD 表型都有不同程度的影響。

6 結語

在過去的十幾年里越來越多的研究組利用無脊椎動物模擬人類退行性疾病，果蠅在研究藥物干預、改善疾病中作出了顯著的貢獻，如揭示了格爾德霉素和分子伴侶能夠調控α-Syn 的毒性等。這些成果表明未來果蠅將繼續(xù)為研究人類退行性疾病做出貢獻。需要指出的是，利用果蠅模型研究PD 具有局限性，果蠅畢竟是較低等的動物，與人類進化關系較遠，果蠅DA神經(jīng)系統(tǒng)的功能也比人類要復雜，因此果蠅模型只能用于前期研究，由它獲得的信息可以使用推測相似的人體基因的功能，最終功能的確認還是要依賴于人類親緣關系較近的模型的驗證。

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