當(dāng)歸地上部分中綠原酸和金絲桃苷的含量測(cè)定

胡淑毅 劉東來(lái)

當(dāng)歸地上部分中綠原酸和金絲桃苷的含量測(cè)定

胡淑毅 劉東來(lái)

目的建立當(dāng)歸地上部分中綠原酸與金絲桃苷的含量測(cè)定方法。方法采用高效液相色譜法，色譜柱為GRACE C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相為乙腈 (A)-0.5%甲酸水溶液 (B)梯度洗脫；流速1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為325 nm(綠原酸)和355 nm(金絲桃苷)。結(jié)果綠原酸和金絲桃苷的線性范圍分別為0.29～5.8μg/μL(R2=0.9996)，0.1～2.0μg/μL(R2=0.9999)；平均加樣回收率分別為為97.34%(RSD=4.77%)，101.70%(RSD=3.07%)。結(jié)論該方法準(zhǔn)確可靠、簡(jiǎn)便可行，可用于當(dāng)歸地上部分藥材的質(zhì)量控制。

當(dāng)歸；綠原酸；金絲桃苷；含量測(cè)定

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis (Oliv.) Diels.的干燥根，是一種常用中藥，具有補(bǔ)血活血，調(diào)經(jīng)止痛，潤(rùn)腸通便之功效[1]。另一方面，在亞洲各國(guó)當(dāng)歸還被廣泛用作食材，并且在歐美也是一種重要的膳食補(bǔ)充劑[2,3]。隨著現(xiàn)代醫(yī)藥工業(yè)的不斷發(fā)展，各種中藥材資源急劇減少，因此，如何合理綜合利用現(xiàn)有資源也成了中藥研究的熱門課題。傳統(tǒng)中當(dāng)歸的非藥用部位也被深入研究，并分離得到很多具有顯著活性的化學(xué)成分，并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸地上部分中含有的綠原酸和金絲桃苷是重要的抗凝血及抗菌活性成分[4]。為了更好地開發(fā)利用豐富的當(dāng)歸地上部分資源，本文首次對(duì)其中的綠原酸和金絲桃苷含量測(cè)定方法進(jìn)行了研究。

1 儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜系統(tǒng) (包括四元泵溶劑系統(tǒng)，在線脫氣機(jī)和自動(dòng)進(jìn)樣器，2998 PDA 檢測(cè)器，EmpowerTM工作站)；電子分析天平(BT-125D，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；超聲波清洗器(KH2200B，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。綠原酸和金絲桃苷對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品鑒定所。甲醇為分析出，乙腈為色譜純；水為超純水。當(dāng)歸地上部分樣品采自甘肅岷縣，經(jīng)作者鑒定為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis (Oliv.) Diels的干燥地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為GRACE C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.5%甲酸水溶液(B)梯度洗脫 (0 ～ 30 min, 5% ～ 35%A)；流速1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)355 nm(金絲桃苷)，325 nm(綠原酸)；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μl。

2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的綠原酸和金絲桃苷對(duì)照品適量，加70 %甲醇制成濃度分別為30 μg/ml和10 μg/ml的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3供試品溶液的制備 精密稱取干燥藥材粉末1.0 g，置具塞三角瓶中，精密加入70%甲醇50 ml，稱定重量，超聲45 min，放冷，再稱定重量，以70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.45 μm的微孔濾膜，即得。

2.4檢測(cè)限與定量限 以信噪比為3:1確定綠原酸的檢測(cè)限為4.0 ng，金絲桃苷的檢測(cè)限為5.8 ng；以信噪比為10 ∶ 1確定綠原酸的定量限為13.5 ng，金絲桃苷的定量限為18.4 ng。

2.5線性關(guān)系考察 取干燥至恒重的綠原酸和金絲桃苷對(duì)照品適量，緊密稱定，置50 ml量瓶中，以70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含綠原酸57.12 μg/ml，金絲桃苷21.04 μg/ml的對(duì)照品貯備液，精密吸取對(duì)照品貯備液適量，分別稀釋成含綠原酸濃度為1.428，2.856，5.712，8.568，11.424，14.280，22.848，28.560，57.12 μg/ml，含金絲桃苷濃度為0.526，1.052，2.104，3.156，4.208，5.260，8.416，10.52，21.04 μg/ml的梯度對(duì)照品溶液，準(zhǔn)確吸取上述對(duì)照品溶液各20 μl，按上述確定的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別以對(duì)照品的含量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，得綠原酸回歸方程為Y=282550X-841.07，R2=0.9999，線性范圍0.02856～1.1424 μg；金絲桃苷回歸方程為Y=128923X+735.46，R2=0.9996，線性范圍0.01052～0.4208 μg。

2.6精密度試驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取供試品溶20 μl，連續(xù)進(jìn)6次，測(cè)定綠原酸和金絲桃苷的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.24%和0.99%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次(20101025)當(dāng)歸地上部分藥材粉末約1.0 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下操作，在上述色譜條件下，分別于0、2、4、6、8、12 h測(cè)定，測(cè)得綠原酸和金絲桃苷色譜峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.44%和1.20%，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次(20101025)當(dāng)歸地上部分藥材粉末6份，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下操作，在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得綠原酸和金絲桃苷色譜含量，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.38%和0.16%。

2.9加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的當(dāng)歸地上部分藥材(20101025)粉末6份，約0.5 g，精密稱定，分別按已知含量100%加入綠原酸和金絲桃苷對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下操作，在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，平均加樣回收率分別為97.34% (RSD=4.77%)，101.70% (RSD=3.07%)。

2.10樣品測(cè)定 分別取不同批次當(dāng)歸地上部分藥材粉末約1.0 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下操作，制成供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μl，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，結(jié)果見表1，色譜圖見圖1。

表1 當(dāng)歸地上部分中綠原酸和金絲桃苷的含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

圖1 高效液相色譜圖

A 對(duì)照品；B 當(dāng)歸地上部分藥材；1 綠原酸；2 金絲桃苷

3 討論

當(dāng)歸為一種藥食兩用的常用中藥材，但在傳統(tǒng)用藥習(xí)慣中當(dāng)歸僅僅以根為入藥部位，每年當(dāng)歸采收后都有大量的地上部分廢棄，不但造成極大浪費(fèi)，還會(huì)污染環(huán)境。通過對(duì)當(dāng)歸地上部分有效成分的研究發(fā)現(xiàn)其中含有很多具有顯著活性的化學(xué)成分，特別是所含有的綠原酸和金絲桃苷是重要的抗凝血及抗菌活性成分[4]。本文首次對(duì)當(dāng)歸地上部分中的綠原酸和金絲桃苷含量測(cè)定進(jìn)行了研究，為當(dāng)歸地上部分的開發(fā)利用提供參考。提取條件的優(yōu)化通過對(duì)提取溶劑，提取方法及提取時(shí)間的考察，確定50 ml 70%甲醇，超聲45 min，可以完全提取1.0 g當(dāng)歸地上部分藥材中的綠原酸和金絲桃苷。

[1] 南京新醫(yī)學(xué)院. 中藥大辭典. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2006, 1207.

[2] Zhao KJ, Dong TX, Tu PF, et al. Molecular genetic and chemical assessment of radix Angelica (Danggui) in china. J Agric Food Chem, 2003, 51(9): 2576-2583.

[3] Deng SX, Chen SN, Yao P, et al. Serotonergic activity-guided phytochemical investigation of the roots of Angelica sinensis. J Nat Prod, 2006, 69(4): 536-541.

[4] Zhou GS, Yang NY, Tang YP, et al. Chemical constituents from the aerial parts of Angelica sinensis and their bioactivities. Chin J Nat Med, 2012, 10(4): 295-298.

DeterminationofchlorogenicacidandhyperosideintheaerialpartofangelicasinensisbyHPLC

HUShu-yi,LIUDong-lai.

LiMinPharmaceuticalFactoryofLIVZONPharmaceuticalGroup,Shaoguan,Guangdong512028,China

ObjectiveTo establish a HPLC method for the determination of chlorogenic acid and hyperoside in the aerial part of angelica sinensis.MethodsThe chromatographic separation was achieved on a GRACE C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm) column at a variable wavelength from 325 nm (Chlorogenic acid) to 355 nm (hyperoside) using a gradient mobile phase consisted of a mixture of acetonitrile (A) and 0.5% formic acid (B) at a flow rate of 1.0 ml/min.ResultsLinearity relationships of chlorogenic acid and hyperoside were 0.29～ 5.8 μg/μl (R2=0.9996), 0.1 ～ 2.0 μg/μl (R2=0.9999), respectively; the average recoveries were 97.34% (RSD=4.77%)，101.70% (RSD=3.07%).ConclusionThe results showed that the method is accurate, simple, repeatable and it is suitable for the quality control of the aerial parts of Angelica sinensis.

Angelica sinensis;Chlorogenic acid;Hyperoside;Content determination

512028 廣東省麗珠集團(tuán)利民制藥廠