HPLC法測定抗骨增生片中芒柄花素的含量

江蘇省鹽城市藥品檢驗(yàn)所（224002）周會芹 鄭灝 支榮榮

抗骨增生片是由熟地黃、鹿銜草、骨碎補(bǔ)、雞血藤、淫羊藿、肉蓯蓉、萊菔子7味藥組成的中藥復(fù)方制劑，其中雞血藤為豆科（Leguminosae）密花豆屬植物密花豆（SpatholobussuberectusDunn.）的干燥藤莖，其性溫，味苦、甘，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)血、活血、通絡(luò)之功效，用于治療月經(jīng)不調(diào)、血虛萎黃、麻木癱瘓、風(fēng)濕痹痛等癥。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，雞血藤主要含有三萜和黃酮類成分，芒柄花素[1]是其中黃酮類成分之一，具有抗菌[2]、抗骨質(zhì)疏松等作用。目前，已有測定抗骨增生片中淫羊藿苷和柚皮苷[3]含量的報(bào)道，但尚未有測定抗骨增生片中芒柄花素含量的文獻(xiàn)報(bào)道，本文采用反相高效液相色譜法測定了抗骨增生片中芒柄花素的含量。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法具有良好精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性，可用于抗骨增生片的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

高效液相色譜系統(tǒng)：Agilent 1200 Series高效液相色譜儀（G1311A四元泵高效液相色譜儀，G1316A柱溫箱，G131413紫外檢測器，G1322A真空脫氣機(jī)），Agilent 1200色譜工作站，XS205電子天平（梅特勒托利多公司）。乙腈為色譜純，水為娃哈哈飲用純凈水，其他試劑均為分析純。芒柄花素對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，批號為111703-200602，供含量測定用?？构窃錾商珮O集團(tuán)四川綿陽制藥有限公司、陜西盤龍制藥集團(tuán)有限公司、廣東羅浮山國藥股份有限公司和山西華康藥業(yè)股份有限公司提供（批號為55120009，55110003，20120601，L12I031，20110402）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

附圖 對照品、樣品、陰性對照圖譜

2.1.1 對照品溶液 精密稱取芒柄花素對照品12.12mg，置25ml量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配得0.4848mg/ml的對照儲備液，精密量取上述對照儲備液1.0ml，置于10ml量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.1.2 供試品及陰性樣品溶液 精密稱取本品及陰性樣品粉末各0.2g（0.4g/片），置錐形瓶中，加入75%甲醇30ml，加熱回流1h，過濾，用75%甲醇適量清洗殘?jiān)腿萜?，蒸干，?5%甲醇溶解，移置5ml量瓶中，搖勻，濾過，即得供試品溶液（0.45μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣）。

2.2 色譜條件 色譜柱： Agilent C18（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈－0.5%磷酸（35∶65）；流速：1.0ml/min；檢測波長：248nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μl；分析時(shí)間：18min。在上述色譜條件下，芒柄花素可達(dá)到基線分離，陰性樣品色譜中在與芒柄花素保留時(shí)間相同的位置沒有色譜峰的干擾，表明該方法有較強(qiáng)的專屬性；經(jīng)計(jì)算得理論塔板數(shù)為10000。見附圖。

2.3 線性關(guān)系考察 精密量取對照品儲備液1.0ml，3.0ml，5.0ml，7.0ml，10.0ml，分別置入50ml量瓶中，分別用甲醇稀釋至刻度，配成系列對照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測定峰面積。以峰面積Y對濃度X（μg）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，芒柄花素進(jìn)樣濃度在0.099～0.994μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，回歸方程為Y＝-2.61473338＋67138.99773710X，R＝0.9999。

2.4 精密度試驗(yàn) 取對照品溶液按“2.2”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積。結(jié)果芒柄花素峰面積的RSD（n＝6）為0.1%。

2.5 檢測限及定量限測定 將芒柄花素色譜峰的信號與基線信號進(jìn)行比較，以信噪比約3∶1注入儀器的量定為檢測限，以信噪比約為10∶1時(shí)注入儀器的量確定為定量限。芒柄花素的檢測限為0.006μg/ml，定量限為 0.02μg/ml，進(jìn)樣量為10μl。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1號樣品供試品溶液分別在0h，2h，4h，8h，16h，24h按“2.2”色譜條件進(jìn)樣測定，芒柄花素峰面積的RSD為0.89%，說明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品（批號為55120009），按供試品溶液制備項(xiàng)下操作，平行制備6份，在上述色譜條件下進(jìn)行分析測定，結(jié)果芒柄花素含量的平均（n＝6）為5.85mg/片，RSD為0.73%，表明重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn) 取已知含量（5.85mg/片，平均片重0.4023g）的樣品（批號55120009）6份，每份0.1g，精密稱定，分別精密加入芒柄花素對照儲備液3ml（1.4544mg），每一濃度3份，按“2.1.2”操作，在“2.2”色譜條件下進(jìn)行分析，計(jì)算低、中、高濃度芒柄花素的回收率，見附表1。

2.9 樣品測定 分別取5個(gè)批號的抗骨增生片，每個(gè)樣品取2份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液10μl，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，測定峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算出芒柄花素含量，見附表2。其中采用248nm的色譜圖基線更穩(wěn)，干擾少，故選擇248nm作為檢測波長。

3 討論

3.1 波長的選擇 結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，測定芒柄花素含量大多使用248nm和254nm，

附表1 加樣回收試驗(yàn)

附表2 抗骨增生片中芒柄花素的含量（n＝2）

3.2 流動(dòng)相的選擇 分別考察了乙腈-水系統(tǒng)和乙腈-0.5%磷酸系統(tǒng)作為流動(dòng)相，結(jié)果表明，以乙腈－0.5%磷酸溶液為流動(dòng)相，所得色譜峰峰形好，分離效果佳。故選擇乙腈-0.5%磷酸系統(tǒng)作為流動(dòng)相。

3.3 提取工藝的考察 以芒柄花素的含量為指標(biāo)考察提取工藝。采用超聲法分別考察甲醇、乙醇的提取效率，結(jié)果表明甲醇的提取效率較高。又以甲醇為提取溶劑，分別考察了超聲法和回流法的提取效率，結(jié)果表明回流法的提取效率優(yōu)于超聲法，故采用回流法。又采用回流法分別考察了體積分?jǐn)?shù)為60%甲醇、體積分?jǐn)?shù)為75%甲醇、體積分?jǐn)?shù)為100%甲醇的提取效率，結(jié)果表明體積分?jǐn)?shù)為75%甲醇的提取效率最高。采用單因素循環(huán)方法，進(jìn)一步考察了溶劑倍數(shù)、提取時(shí)間和提取次數(shù)3個(gè)因素，最后選擇的最佳提取工藝為30倍量體積分?jǐn)?shù)為75%甲醇回流1h提取1次。

3.4 樣品的處理方式 考察了未使用0.45μm薄膜過濾和使用薄膜過濾的樣品，發(fā)現(xiàn)過濾過的樣品所得色譜峰峰形好，分離效果佳，雜峰較少。

3.5 小結(jié) 本文建立的方法能準(zhǔn)確地測定抗骨增生片中芒柄花素的含量，且該方法簡便、可靠、重復(fù)性好；同時(shí)本文測定了5批抗骨增生片中芒柄花素的含量，結(jié)果含量最大值為5.85μg/ml，最小值為0.95μg/ml，平均值為2.64μg/ml，為制定含量限度提供了依據(jù)。