青霉素菌絲體中麥角固醇分離和純化研究

劉玲，吳正奇，王雄，萬端極

（1.湖北工業(yè)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢430068；2.湖北工業(yè)大學(xué)膜技術(shù)研究所，湖北 武漢430068）

0 引言

麥角固醇又稱麥角甾醇，是脂溶性維生素D2的前體，當(dāng)受到紫外線照射時，分子中4個碳環(huán)中的一個發(fā)生斷裂，變成維生素D2；此外還可作為可的松、黃體酮、蕓苔素內(nèi)酯等物質(zhì)的生產(chǎn)原料［1].

目前國內(nèi)外麥角固醇的生產(chǎn)方式有2種，一種是用微生物發(fā)酵法，所用菌種有酵母菌、曲霉和青霉等［2-4]，但發(fā)酵成本高，不利于大工業(yè)化生產(chǎn).另一種是用醇堿法從菌絲體中皂化提取，即用一定濃度的堿與醇混合液來提取，提取后的上清液再用乙醚萃取得麥角固醇［5-6]，此法在反應(yīng)和萃取階段使用了大量的有機(jī)溶劑，溶劑回收費(fèi)用高，生產(chǎn)安全性差.

目前常用的麥角固醇提取純化方法是用石油醚、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑反復(fù)萃取提純［7].有機(jī)溶劑用量大，溶劑回收費(fèi)用高昂、成本居高不下.

本文中采用堿溶液來皂化麥角固醇，將菌絲體中的結(jié)合態(tài)麥角固醇變?yōu)橛坞x態(tài)，再酶解，將堿提后渣中的醇溶性蛋白水解為多肽溶于水相，用乙醇萃取可得到純度較高的麥角固醇產(chǎn)品.本工藝避免了提取和純化過程中有機(jī)溶劑的大量使用，大大減少麥角固醇的生產(chǎn)成本，為麥角固醇的生產(chǎn)開創(chuàng)了一條新生產(chǎn)工藝，同時也為麥角固醇的提純提供了新方法.

1 實驗部分

1.1 材料 青霉素濕菌絲（華北制藥有限公司發(fā)酵自制）；麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品為Singma公司產(chǎn)品.

木瓜蛋白酶，南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；堿性蛋白酶，無錫杰能科生物工程有限公司；風(fēng)味蛋白酶，Novo酶制劑公司；復(fù)合蛋白酶，Novo酶制劑公司.

1.2 主要實驗儀器 PHS-3C型數(shù)顯酸度計：杭州奧立龍儀器有限公司；HX1201Z型電子天平：慈溪市天冬衡器廠；H H-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市城西曉陽電子儀器廠；JJ-1型精密增力電動攪拌器：江蘇曉陽電子儀器廠；TDL-5-A型低速大容量離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；戴安Ulti Mate3000液相色譜儀：石家莊博萊特儀器有限公司.

1.3 實驗方法 設(shè)定實驗工藝如下：

青霉素濕菌絲體→濾干→堿提→渣→醇提→旋蒸→粗品→加水酶解→過濾→醇提→旋蒸→高純度麥角固醇.

實驗操作：將濾干后的菌絲體，按照物料比1∶15，加入15%的NaOH溶液中，在85℃的水浴鍋中提取2 h.堿提后的溶液離心，將渣加入一定量的乙醇溶液常溫下提取30 min.醇提液旋蒸可得到麥角固醇粗品.粗品加水加酶進(jìn)行酶解，過濾，再用乙醇萃取濾紙上的不溶物，提取液旋蒸結(jié)晶可得到高濃度的麥角固醇.

1.3.1 堿提 根據(jù)工藝選擇物料皂化劑比（A），皂化溫度（B），用堿濃度（C），皂化時間（D）這4個因素作為考察對象，每個因素各取3個水平，以麥角固醇的皂化收率為指標(biāo)，通過正交試驗，得出最佳皂化條件（表1）.

表1 因素水平表

1.3.2 最佳用酶選擇 青霉素菌絲體中各成分含量如下：蛋白42%～43%，麥角固醇0.8%～1.2%，脂肪1.7%～2.0%，無機(jī)鹽4%，灰分6%～7%，其余為纖維素.在堿提過程中大部分蛋白、脂類物質(zhì)、無機(jī)鹽都被除去，渣中主要為纖維素、麥角固醇、灰分和一些不溶于水的蛋白.由于菌絲體中的纖維素不溶于水，所以渣經(jīng)一次醇提后的溶液中主要是麥角固醇和蛋白.本工藝中酶解的目的是將粗品中的醇溶性蛋白水解為多肽溶于水相，使之與不溶于水的麥角固醇分離達(dá)到純化的目的.

本實驗選用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶在其各自最佳水解條件下對麥角固醇粗品進(jìn)行水解，加酶量為3%，以工藝最后得到的產(chǎn)品中麥角固醇的純度為指標(biāo)確定最佳用酶種類（表2）.

1.3.3 酶解正交試驗 酶解過程中，溫度、時間、酶用量是影響酶解效果的主要因素.因此，將溫度、時間、酶用量3個因素進(jìn)行正交實驗，因素水平如表3所示.

表2 各種酶的最佳水解條件

表3 酶解正交因素水平表

1.4 分析方法

1.4.1 麥角固醇含量測定和分析方法 采用高效液相色譜法對麥角固醇進(jìn)行測定：高效液相色譜條件為色譜柱 HC-C18（4.6 mm×150.0 mm，5μm），流動相為純甲醇，流速1.5 m L／min，檢測波長281 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL.采用外標(biāo)法按峰面積進(jìn)行定量［8-9].另外選取一定量的麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品，用乙醇溶解配制一系列濃度的麥角固醇，在已建立的色譜條件下檢測，然后對萃取后的樣品進(jìn)行HPLC分析，計算峰面積并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，得出所測麥角固醇的含量.

麥角固醇得率計算公式：麥角固醇／%＝［（C×V×N）／W]×100.式中，C為麥角固醇的質(zhì)量濃度（g／m L），V為溶液體積（m L），N為稀釋倍數(shù)，W為菌體干質(zhì)量（g）.

1.4.2 菌絲體中麥角固醇最大含量的確定 利用最后結(jié)論3中得出的最佳堿提條件對原料進(jìn)行最大化提取，得出菌絲體中麥角固醇最大含量為1.2%.

1.4.3 麥角固醇純度計算方法 麥角固醇純度／%＝醇提液的體積×醇提液中麥角固醇的濃度／醇提液結(jié)晶后的固體質(zhì)量×100.

2 結(jié)果和討論

2.1 堿提正交試驗結(jié)果 從正交實驗可以看出各因素影響麥角固醇提取率的主次順序為B＞C＞D＞A.最優(yōu)條件參數(shù)組合為A3B2C3D2，即在物料比1∶15，溫度85℃，NaOH濃度為15%，提取時間2 h的條件下，提取率最高（表4）.該條件表中沒有，因此需做驗證實驗，經(jīng)驗證在該條件下提取率為99%.并且通過液相檢測結(jié)果，計算得粗品中麥角固醇的純度為34%.

表4 正交試驗結(jié)果

2.2 水解用酶的選擇 由圖1可知，堿性蛋白酶的水解效果最好，經(jīng)該酶水解后制得產(chǎn)品中麥角固醇的純度可達(dá)到67%.因此本實驗選取堿性蛋白酶為水解用酶.

圖1 各酶在其最佳條件下的水解效果圖

2.3 酶解正交實驗 由表5的R值看出，各因素對實驗結(jié)果影響的主次順序為：E＞G＞F.最優(yōu)條件參數(shù)組合為：E2F2G2，即在溫度為45℃，酶解時間2 h，加酶量為2.0%的條件下，為最優(yōu)工藝條件.該條件表中沒有，因此需做驗證實驗，經(jīng)驗證在該條件下，麥角固醇純度為70%，產(chǎn)品的得率為95%.所以最優(yōu)工藝條件為：溫度45℃，酶解時間2 h，加酶量為2.0%.

表5 正交試驗結(jié)果

3 結(jié)論

本研究以濕菌體直接加堿皂化及酶法純化除雜的方法，取代傳統(tǒng)工藝中直接加入有機(jī)溶劑回流提取以及多種有機(jī)溶劑反復(fù)萃取提純的方法，大大降低了有機(jī)溶劑用量.以麥角固醇的提取率為指標(biāo)，通過正交篩選出最佳皂化條件為：物料皂化劑比1∶15，NaOH溶液濃度為15%，溫度85℃，皂化時間2 h.以麥角固醇酶解后純度為指標(biāo)，選擇堿性蛋白酶在溫度45℃，時間2 h，加酶量2.0%，p H＝8的條件下酶解.最終產(chǎn)品中麥角固醇的純度可達(dá)到70%，提取率可達(dá)到95%.

［1]李蓮英，張志敏.維生素 D攝入不足對兒童健康的影響［J].中國兒童保健雜志，1997，5（2）：122.

［2]Wang Tianqi，Li Hanxiang，Wang Manyi，et al.Integrative extraction of ergosterol-（1-3）-α-D-glucan and chitosan fromPenicilliumchrysogenumMycelia［J].Chin Chem Eng，2007，15（5）：725-729.

［3]譚艾娟，寧瑋霽，劉愛英，等.紅曲霉產(chǎn)麥角固醇液體發(fā)酵條件優(yōu)化［J].食品科技，2008，29（9）：434-436.

［4]江宏文，張毅，李娜，等.酵母菌株產(chǎn)麥角固醇發(fā)酵條件優(yōu)化［J].現(xiàn)代食品科技，2009，25（7）：801-802.

［5]韓慶雪，聞建平，馮國龍.麥角固醇工業(yè)化提取工藝研究［J].河北化工，2007，30（2）：42-45.

［6]南春輝.麥角固醇研究進(jìn)展［J].中國新技術(shù)新產(chǎn)品，2009（10）：9-10.

［7]邱從平，張慧波，施立欽，等.麥角固醇提取及分離純化研究［J].醫(yī)藥衛(wèi)生論壇，2005（12）：138-139.

［8]孫佰申，周立平，陳旭峰，等.HPLC法測定紅曲霉發(fā)酵樣品中麥角固醇的含量［J].中國食品添加劑，2004（2）：89-92.

［9]李敏，董慧.雙水相萃取—高效液相色譜法測定酵母細(xì)胞中麥角固醇含量［J].分析試驗室，2009，28（11）：119-120.