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    規(guī)模豬場保育豬副豬嗜血桿菌感染的診斷與分析

    2013-10-18 07:39:04李潤成
    湖南畜牧獸醫(yī) 2013年2期
    關(guān)鍵詞:嗜血血清型小豬

    王 湘,李潤成

    (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,湖南長沙 410131)

    副豬嗜血桿菌引起的疾病又叫做革拉澤氏?。℅lasser’s Disease),可感染2周齡到4月齡的青年豬。臨床上表現(xiàn)為呼吸綜合征,特異性表現(xiàn)為纖維素性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎以及急性敗血病。副豬嗜血桿菌內(nèi)毒素可引起彌漫性血管內(nèi)凝血,導(dǎo)致不同組織微血栓的形成[1]。本文對湖南耒陽一豬場保育豬的發(fā)病情況做了簡要介紹,并對該豬場的保育豬發(fā)生副豬嗜血桿菌感染進(jìn)行了細(xì)菌分離及疾病的診斷分析,現(xiàn)報(bào)告如下:

    1 材料和方法

    1.1 病料來源

    湖南耒陽某豬場送檢的保育豬6頭,其中發(fā)病早期的1頭、中期的2頭、后期的3頭。(該豬場自2012年9月份開始50~80日齡的保育豬陸續(xù)出現(xiàn)皮毛粗亂,食欲減退,后期四肢腫大,不能站立的情況。發(fā)病率20%~30%左右,保育舍小豬總死亡率達(dá)10%左右)。

    1.2 主要的試劑及培養(yǎng)基

    Taq- plus 酶,dNTP、DNA Marker,革蘭氏染色試劑盒,巧克力培養(yǎng)基,血瓊脂培養(yǎng)基,TSB 培養(yǎng)基,NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸),小牛血清。

    1.3 送檢病豬的臨床與解剖病變觀察

    將送檢病豬放于解剖室觀察其外部特征及行為表現(xiàn)后按常規(guī)方法處死并進(jìn)行解剖觀察、采樣。

    1.4 細(xì)菌的分離

    從采集的病豬脾臟、肺臟、關(guān)節(jié)液無菌鉤取組織樣本,劃線接種于巧克力及血瓊脂平板后,巧克力平板放于燭缸進(jìn)行培養(yǎng),血平板直接放于恒溫箱中,37℃培養(yǎng)48 h后觀察細(xì)菌生長情況。

    1.5 細(xì)菌的增菌培養(yǎng)及PCR鑒定

    挑取形態(tài)上具有代表性的單個(gè)菌落劃線接種巧克力培養(yǎng)基,待菌落長出后進(jìn)行革蘭染色鏡檢和PCR鑒定。PCR鑒定采用細(xì)菌通用引物進(jìn)行,引物資料見文獻(xiàn)[2],PCR方法按常規(guī)操作,并于PCR擴(kuò)增后將產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)有限公司測序鑒定。

    1.6 藥敏試驗(yàn)

    挑取純培養(yǎng)的單個(gè)菌落,于含100μg/mL N A D的T S B液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)后采用紙片法進(jìn)行藥敏檢測。

    2 結(jié)果

    2.1 送檢病豬的臨床表現(xiàn)及解剖病變

    從送檢的病豬可見6頭小豬均表現(xiàn)出消瘦,皮毛粗亂(圖1),其中有3頭發(fā)病后期的小豬四肢腫大(圖2)。6頭豬中只有2頭發(fā)病后期的豬表現(xiàn)出胸腔有嚴(yán)重的纖維素性滲出,1頭發(fā)病中期的小豬脾臟明顯腫大。其他均未見到嚴(yán)重病變。

    2.2 細(xì)菌的分離、鑒定結(jié)果

    2.2.1 細(xì)菌分離及革蘭染色鏡檢結(jié)果

    從采集的6頭小豬脾臟、肺臟、關(guān)節(jié)液分別無菌鉤取組織,劃線接種巧克力及血瓊脂平板。結(jié)果1頭發(fā)病初期以及2頭發(fā)病中期小豬脾臟接種的巧克力平板長出了一些形態(tài)一致的針尖大小菌落。其他均未見到細(xì)菌生長。劃線培養(yǎng)的細(xì)菌革蘭染色鏡檢均為絲狀陰性細(xì)菌(見圖3)。

    2.2.2 PCR鑒定結(jié)果

    挑取純培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,并于PCR擴(kuò)增后將產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。將測出序列進(jìn)行Blast 分析發(fā)現(xiàn)此次分離的菌株為副豬嗜血桿菌,為了進(jìn)一步確認(rèn)該菌株的血清型,使用Lasergene 分析軟件中的MegAlign 程序,運(yùn)用Clustal W方法對所測序列與參考序列進(jìn)行比較,并繪制和分析遺傳進(jìn)化樹(圖4)。結(jié)果表明,該菌株(LY.seq)與GenBank 中登錄的部分1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、14 血清型的16S rRNA 同源性為96.3%~99.0%,與GenBank登錄號為AB078974 以及AB078974 的兩株血清5 型的菌株構(gòu)成一個(gè)分支,同源性高達(dá)99.0%。因此將該分離株最后確認(rèn)為HPS 血清5 型細(xì)菌。

    2.3 藥敏結(jié)果

    挑取純培養(yǎng)的單個(gè)菌落,于含100 μg/mL NAD的TSB 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)后,采用紙片法進(jìn)行藥敏檢測。抑菌圈直徑在15 mm以下,判為該菌對藥物低度敏感;直徑在15 mm~20 mm之間判為中度敏感;大于20 mm判為細(xì)菌對該藥極度敏感,建議此類藥物作為臨床用藥的首選。試驗(yàn)結(jié)果見表1。

    ?

    由表1可見該細(xì)菌對頭孢噻吩、先鋒霉素V、強(qiáng)力霉素、氯霉素等藥物高度敏感,對慶大霉素、新霉素、環(huán)丙氟哌酸等藥物中毒敏感,對鏈霉素低度耐藥。

    3 討論

    豬是副豬嗜血桿菌的天然宿主。隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,副豬嗜血桿菌引起的疾病感染在我國各地也屢見不鮮且日益嚴(yán)重,疾病感染導(dǎo)致的高死亡率以及應(yīng)用大量抗生素治療給廣大養(yǎng)殖戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在一個(gè)豬群中,副豬嗜血桿菌的致病力是影響全身疾病嚴(yán)重程度或發(fā)生、發(fā)展的因素,通??梢詮呢i的上呼吸道分離出該菌的一些血清型,這其中包含了一些很少能從全身其他部位分離出的血清型,分離細(xì)菌的部位常影響副豬嗜血桿菌病判定的精確性。副豬嗜血桿菌可作為豬呼吸道疾病綜合征的病原體,也可以作為一種易感病原,或是作為引起肺炎的次要或主要病原體。當(dāng)動(dòng)物機(jī)體感受到外部環(huán)境產(chǎn)生的壓力,如不良的飼養(yǎng)環(huán)境,斷奶、轉(zhuǎn)群、運(yùn)輸?shù)然蛏i存在藍(lán)耳病毒感染時(shí),副豬嗜桿菌對生豬造成感染發(fā)病的機(jī)率會(huì)大大增加。單純的HPS感染時(shí)引發(fā)的臨床癥狀、剖檢病變以及流行病學(xué)特征與傳染性胸膜肺炎、支原體肺炎、以及豬的鏈球菌感染均有相似之處,在臨床上也很難進(jìn)行區(qū)分,所以在對該菌的感染進(jìn)行確診時(shí)需要借助實(shí)驗(yàn)室檢測手段。

    副豬嗜血桿菌 15種血清型中 1、5、10、12、13、14為高致病性毒株;血清型2、4、15為中等毒力株;3、6、7、8、9、11為低致病力毒株,且感染豬后沒有明顯的臨床癥狀[3,4],其中還有20%的菌株未能進(jìn)行分型。運(yùn)用PCR方法擴(kuò)增細(xì)菌的16 SrRNA后進(jìn)行測序,將得到的序列與Gen Bank中的各血清型序列進(jìn)行比較,可以方便快速的鑒定副豬嗜血桿菌,提高了診斷HPS感染的效率。而且隨著分離菌株的增加,利用此方法也可以更好的收集HPS跟血清型感染的數(shù)據(jù),為副豬嗜血桿菌病的防制提供了科學(xué)的參考依據(jù)。

    此次送檢的病豬為6頭,病豬表現(xiàn)的臨床癥狀相似,結(jié)果卻只在發(fā)病的3頭小豬脾臟中分離到副豬嗜血桿菌,而在小豬明顯腫大的關(guān)節(jié)腔中卻未分離到細(xì)菌。經(jīng)過調(diào)查了解到該豬場在病豬送檢之前曾使用了大量的抗生素進(jìn)行治療,這可能是在關(guān)節(jié)液與肺臟中未分離到病原菌的原因之一。此次細(xì)菌分離提示臨床診斷副豬嗜血桿菌病例應(yīng)選用發(fā)病早期,且未經(jīng)抗生素治療的病豬作為診斷對象比較可靠。畜主在使用抗生素之前也應(yīng)對抗生素的種類進(jìn)行挑選與分析,避免盲目用藥后病原菌產(chǎn)生耐藥性。本文將該豬場保育豬病例診斷為存在副豬嗜血桿菌感染,并進(jìn)行藥物敏感性檢測,建議豬場采用敏感藥物進(jìn)行藥物保健與防控,取得了一定的效果。 □

    [1] Amano H.,Shibata M.,Kajio N.,Morozumi T.Pathologic observations of pigs intranasally inoculated with serovar 1,4 and 5 of Haemophilus parasuis using immunoperoxidase method[J].Journal of Veterinary Medical Science,1994,56,639~644.

    [2] Run-Cheng LI,Chao-Ting Xiao,Xing Qian,et al.Occurrence of Streptococcus dysgalactiae subsp.equisimilis in Masked Palm Civet(Paguma larvata)[J].Journal of Animal and Veterinary Advances,2012,11(12):2020~2023.

    [3] Nielsen R.Pathogenicity and immunity studies of Haemophilus parasuis sexotypes[J].Acta Vet Scand,1993,34(2):193~198.

    [4] Kielstein P,Rapp-Gabrielson V J.Designation of 15 serovars of Haemophilus parasuis on the basis of immunodiffusion using heat-stable antigen extracts[J].J Clin Microbiol,1992,30:862~865.

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