蜜環(huán)菌提取物抗氧化及抑菌活性研究

翟鳳艷,張方鵬,崔明洋,劉英杰

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

蜜環(huán)菌[Armillariella melle a（Vahl.ex Fr.）Karst]是我國(guó)一種珍貴的藥食兼用真菌,隸屬于擔(dān)子菌門(mén),擔(dān)子菌綱,傘菌目,口蘑科,其子實(shí)體又稱(chēng)榛蘑,廣泛分布于溫帶地區(qū)[1].蜜環(huán)菌美味可口,含有人體必需的多種氨基酸、微量元素及維生素[2].經(jīng)常食用可增強(qiáng)機(jī)體免疫力,具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗衰老、增強(qiáng)耐缺氧能力等作用[3-4].

國(guó)內(nèi)外對(duì)蜜環(huán)菌多糖進(jìn)行的藥理學(xué)研究表明,其具有抗輻射、促進(jìn)造血、抑制腫瘤生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用[5],因此迄今為止蜜環(huán)菌多糖的提取及生物活性得到了廣泛的研究,但對(duì)蜜環(huán)菌其他成分及其功能的研究鮮見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道.本研究從清除DPPH·、清除羥基自由基·OH和清除超氧陰離子自由基·三方面研究了蜜環(huán)菌子實(shí)體、液體發(fā)酵菌絲體及菌索乙醇提取物的體外抗氧化效果及抑菌活性,為蜜環(huán)菌生物活性的深入研究及開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種 蜜環(huán)菌干子實(shí)體,購(gòu)于昆明食用菌研究所；蜜環(huán)菌菌種,購(gòu)于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究所；供試菌種為4種細(xì)菌,分別是金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus Rosenbach,產(chǎn)氣桿菌Bacillas perfringens Veillon et Zuber,變形桿菌 Bacterium proteus Weil et Felix,枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis（Ehrenberg）Cohn,用以測(cè)定蜜環(huán)菌提取液抑菌活性.供試菌種由河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供.

1.1.2 試劑與儀器 DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品,鄰苯三酚、三羥甲基胺基甲烷（Tris）、抗壞血酸、水楊酸、硫酸亞鐵、H2O2、無(wú)水乙醇、鹽酸等,均為國(guó)產(chǎn)分析純.TU-1 201紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蜜環(huán)菌提取物的制備

子實(shí)體提取物制備：將蜜環(huán)菌子實(shí)體在40℃烘箱中烘干至恒重,粉碎,稱(chēng)取100 g干粉,加入200 mL體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇浸泡24 h,過(guò)濾,收集濾液.用相同方法重復(fù)提取3次,合并提取液,置于55℃的恒溫水浴鍋中,直至提取液完全揮發(fā),再用體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇將剩余提取物重新溶解,定容至100 mL,得到質(zhì)量濃度為1 g/mL的子實(shí)體提取液,于磨口瓶中儲(chǔ)存?zhèn)溆?

液體發(fā)酵菌絲體提取物制備：將蜜環(huán)菌菌種用PDA培養(yǎng)基于25℃條件下活化,無(wú)菌條件下將幼嫩菌索接種入裝有150 mL PD培養(yǎng)液的錐形瓶中,置于25℃的恒溫?fù)u床中,120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)2周,過(guò)濾得液體發(fā)酵菌絲體,置于40℃烘箱中烘干至恒重,得3.5 g干品,用200 mL體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇浸泡24 h,過(guò)濾,收集濾液.用相同的方法重復(fù)提取3次,合并提取液,置于55℃的恒溫水浴鍋中,直至提取液完全揮發(fā),再用3.5 mL體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇將剩余提取物重新溶解,得到質(zhì)量濃度為1 g/mL的菌球提取液,于磨口瓶中儲(chǔ)存?zhèn)溆?

菌索提取物制備：將蜜環(huán)菌菌種用PDA培養(yǎng)基于25℃條件下擴(kuò)繁,剔除培養(yǎng)基,用清水沖洗,收集得蜜環(huán)菌菌索,置于40℃烘箱中烘干至恒重,得7.0 g干品,用200 mL體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇浸泡24 h,過(guò)濾,收集濾液.用相同的方法重復(fù)提取3次,合并提取液,置于55℃的恒溫水浴鍋中,直至提取液完全揮發(fā),再用7.0 mL體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇將剩余提取物重新溶解,得到質(zhì)量濃度為1 g/mL的菌索提取液,于磨口瓶中儲(chǔ)存?zhèn)溆?

1.2.2 抗氧化活性測(cè)定

清除DPPH·活性測(cè)定：根據(jù)Astrid von Gadow等的方法[6],分別取質(zhì)量濃度為1.0、0.5、0.2 g/mL的乙醇提取物溶液2 mL,加入0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液2 mL,搖勻后,于室溫下在黑暗處反應(yīng)30 min.以無(wú)水乙醇調(diào)零,測(cè)定517 nm處的吸光值A(chǔ)樣品.同時(shí),測(cè)定2.0 mL乙醇提取物溶液與2.0 mL乙醇混合液在517 nm處的吸光值A(chǔ)空白,再測(cè)定2.0 mL DPPH乙醇溶液與2.0 mL乙醇在517 nm處的吸光值A(chǔ)對(duì)照.每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次,取其吸光度的平均值.用相同的方法測(cè)定與乙醇提取物樣品相同濃度的抗壞血酸對(duì)DPPH·的清除能力.清除率計(jì)算公式為：

清除·OH活性測(cè)定：參照陳留勇等修改后的Smirnoff水楊酸法[7-8].反應(yīng)體系中分別含8.8 mmol/L的H2O2溶液1 mL,9 mmol/L的FeSO4溶液1 mL,9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液1 mL和1 mL質(zhì)量濃度梯度為1.0、0.5、0.2 g/mL的乙醇提取物溶液.其中,H2O2最后加入并啟動(dòng)整個(gè)體系,37℃水浴中反應(yīng)30 min.以蒸餾水作空白對(duì)照,每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)測(cè)定3次,取其吸光度的平均值.用相同的方法測(cè)定與乙醇提取物樣品相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸對(duì)·OH的清除能力.清除率計(jì)算公式為：

式中：A本底為樣品溶液的本底吸光值（即加入FeSO4、水楊酸、乙醇提取物溶液,不加H2O2的吸光度值）.

式中：A本底為用水代替鄰苯三酚時(shí)不同乙醇提取物質(zhì)量濃度下測(cè)得的吸光值.

1.2.3 抑菌活性測(cè)定

菌種活化：將保存的細(xì)菌菌種在無(wú)菌條件下接種于滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上,置于32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

菌懸液的制備：用比濁法[10]制備菌懸液,麥法蘭云度計(jì)可作為混濁度的比較標(biāo)準(zhǔn).取潔凈試管加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的BaCl2溶液0.1 mL,體積分?jǐn)?shù)為1%的H2SO4溶液9.9 mL,以此混濁度相當(dāng)于3×108細(xì)菌數(shù),分別制備以上供試菌種的菌懸液.

抑菌試驗(yàn)：在無(wú)菌條件下用移液槍移取1 mL制備好的菌懸液與熔化后的培養(yǎng)基在培養(yǎng)皿中混合均勻.待凝固后取滅過(guò)菌的直徑為6 mm的濾紙片,將濾紙片在制備好的質(zhì)量濃度為1 g/mL的蜜環(huán)菌子實(shí)體、液體發(fā)酵菌絲體和菌索乙醇提取液中充分浸泡后放置培養(yǎng)皿中,每皿3個(gè)濾紙片均勻放置.對(duì)照組濾紙片用體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇浸泡.每種病原細(xì)菌設(shè)置1個(gè)對(duì)照,3個(gè)重復(fù).放置25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),48 h后觀察,用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,以其平均值表示菌落生長(zhǎng)直徑,計(jì)算抑菌率.

菌落平均直徑/mm=培養(yǎng)皿直徑-抑菌圈平均直徑-濾紙片直徑

抑菌率/%=（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對(duì)照組菌落直徑×100

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化活性

蜜環(huán)菌子實(shí)體、液體發(fā)酵菌絲體、菌索乙醇提取物及相同濃度抗壞血酸抗氧化活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 蜜環(huán)菌提取物及抗壞血酸抗氧化活性Fig.1 Antioxidantactivity of Armillariella mellea extracts and Vc

由表1可知,蜜環(huán)菌子實(shí)體、液體發(fā)酵菌絲體及菌索乙醇提取物對(duì)3種自由基均具有一定的清除能力,且濃度越高,清除效果越好,但清除能力均低于對(duì)照天然抗氧化劑抗壞血酸.3種提取物對(duì)DPPH·的清除率最高,對(duì)·OH的清除率次之,對(duì)·的清除率最低.子實(shí)體和液體發(fā)酵菌絲體提取物對(duì)DPPH·清除率高于菌索提取物,子實(shí)體提取物對(duì)·OH清除效果明顯優(yōu)于液體發(fā)酵菌絲體及菌索提取物,液體發(fā)酵菌絲體對(duì)·清除能力最差.

2.2 抑菌活性

蜜環(huán)菌子實(shí)體、液體發(fā)酵菌絲體、菌索乙醇提取物對(duì)4種供試細(xì)菌的抑制作用結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 蜜環(huán)菌提取物抑菌活性Fig.2 Antibacterial activity of Armillariella mellea extracts

由表2可知,在1 g/mL質(zhì)量濃度下,蜜環(huán)菌不同乙醇提取物對(duì)4種供試細(xì)菌的抑菌效果都不高,且對(duì)不同供試細(xì)菌作用效果不一致.子實(shí)體乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑制效果好于產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌；液體發(fā)酵菌絲體提取物對(duì)變形桿菌的抑制效果稍好,對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌次之,對(duì)產(chǎn)氣桿菌的抑制效果最差；菌索提取物對(duì)枯草芽孢桿菌、產(chǎn)氣桿菌的抑制作用好于變形桿菌,對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最差.

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用天然抗氧化劑抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照,通過(guò)蜜環(huán)菌子實(shí)體、液體發(fā)酵菌絲體、菌索乙醇提取物和抗壞血酸幾者之間抗氧化作用的比較,研究了蜜環(huán)菌不同材料乙醇提取物對(duì)DPPH·、·OH和3種自由基的清除能力,以及其對(duì)4種供試細(xì)菌的抑制作用.結(jié)果表明,蜜環(huán)菌提取物在質(zhì)量濃度為1 g/mL的條件下,對(duì)金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌和枯草芽孢桿菌4種供試細(xì)菌的抑菌活性都不高,最大抑菌率僅達(dá)到15.77%.這可能與提取物濃度偏低有關(guān),在高濃度條件下蜜環(huán)菌提取物對(duì)幾種供試細(xì)菌及其他病原細(xì)菌的抑菌活性有待進(jìn)一步研究.在不同濃度條件下,蜜環(huán)菌3種醇提物對(duì)DPPH·、·OH、和3種自由基都表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力,且清除效果與濃度呈顯著的正相關(guān),但都低于相同濃度的陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸.3種提取物對(duì)DPPH·的清除率最高,對(duì)O2-·的清除率最低,另外不同提取物對(duì)不同的自由基清除作用存在差異,可能是因?yàn)樽訉?shí)體、液體發(fā)酵菌絲體及菌索培養(yǎng)條件差異導(dǎo)致抗氧化活性成分不同.綜上所述,蜜環(huán)菌多糖具有一定的抗氧化能力,可用于制備具有抗氧化活性的天然活性物質(zhì)和開(kāi)發(fā)蜜環(huán)菌多糖類(lèi)藥物及功能性食品,但在較高濃度下蜜環(huán)菌提取物的抗氧化活性、抗壞血酸的清除能力差異以及不同材料抗氧化活性物質(zhì)仍需進(jìn)行深入研究.

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