大慶聚合物驅(qū)后二類油層細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性分析

張繼元

（中國(guó)石油大慶油田有限責(zé)任公司 勘探開發(fā)研究院，黑龍江 大慶163712）

大慶薩中開發(fā)區(qū)中新201注聚站是薩Ⅲ組二類油層開展聚合物驅(qū)較早的區(qū)塊之一[1］。2002年9月開始注聚合物，2002年12月見效，2003年5月到達(dá)產(chǎn)量高峰期，2004年6月含水率開始回升，經(jīng)過(guò)多年聚合物驅(qū)開發(fā)，階段提高采收率9.48%，目前已進(jìn)入后續(xù)水驅(qū)[2］。為了將聚合物驅(qū)后油藏中的剩余油作為挖潛對(duì)象，有必要開展內(nèi)源微生物驅(qū)油提高采收率的可行性研究[3，4］。

認(rèn)知油藏微生物的種群多樣性、群落變化和演替是開發(fā)、調(diào)控、應(yīng)用油藏微生物采油技術(shù)的關(guān)鍵。以往采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法分析大慶內(nèi)源微生物的群落組成[5，6］，所獲信息不全面，很難對(duì)油藏中的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行準(zhǔn)確的分析，因而無(wú)法掌握環(huán)境中微生物群落的真實(shí)情況[7］。為此，近年來(lái)通過(guò)分子生物學(xué)方法研究大慶聚合物驅(qū)、水驅(qū)和過(guò)渡帶油藏微生物的報(bào)道很多[8－12］，其中多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）－變性梯度凝膠電泳（DGGE）方法被廣泛應(yīng)用于分析油藏微生物群落結(jié)構(gòu)并監(jiān)測(cè)微生物群落動(dòng)態(tài)變化[13－15］。

作者利用PCR－DGGE技術(shù)對(duì)薩中開發(fā)區(qū)薩Ⅲ組二類油層的細(xì)菌群落進(jìn)行分析，揭示注采系統(tǒng)中微生物群落的結(jié)構(gòu)、多樣性和分布變化，擬為聚合物驅(qū)后油藏開展內(nèi)源微生物驅(qū)油提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 樣品的采集及預(yù)處理

樣品取自中新201注聚試驗(yàn)區(qū)的5口注水井和9口采油井的采出液，開采層系為薩Ⅲ組二類油層，地層溫度為41～45℃，地下原油粘度為9.3mPa·s，原始地層水礦化度約為7000mg·L－1。

現(xiàn)場(chǎng)用滅菌的塑料桶從注水井和采油井中收集水樣，采集后迅速運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行DNA提取和后續(xù)分析。將水樣在4℃下以6000r·min－1離心15min，獲得菌體。用10mL正己烷溶解離心管中剩余油樣，充分振蕩后，以10 000r·min－1離心15min，得到的菌體用pH值7.2的磷酸鹽緩沖溶液充分洗滌后與水相中的菌體合并，立刻進(jìn)行基因組提取或保存于－20℃。

1.2 水樣微生物基因組的提取

采用玻璃珠研磨－酶法－SDS相結(jié)合的方法提取基因組，具體步驟：（1）將離心所得菌體重懸于1mL Lysis buffer（50mmol·L－1Tris，40mmol·L－1EDTA，0.1mol·L－1NaCl，pH 值8）中，加入0.3g直徑0.1mm的玻璃珠，以4800r·min－1渦旋1min，然后冰浴1min，反復(fù)3次。（2）加入10mg·mL－1溶菌酶，輕輕混勻，于37℃保溫1h后加入100μL 20%SDS和200μL蛋白酶K，混勻后于65℃保溫30min；加入與上清液等量的酚－氯仿－異戊醇溶液（體積比25∶24∶1），進(jìn)行蛋白抽提，反復(fù)抽提直至中間沒(méi)有明顯的蛋白層為止。（3）將上層清液轉(zhuǎn)移到新離心管中，加入0.6BV的異丙醇溶液，室溫靜置30min；在4℃下，以10 000r·min－1離心15min，棄上層清液，加入1mL體積分?jǐn)?shù)為70% 的乙醇洗滌，離心，風(fēng)干沉淀，溶于適量 TE緩沖溶液（10mmol·L－1Tris，1mmol·L－1EDTA，pH 值8.0）中。（4）用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取的基因組。

1.3 細(xì)菌16SrDNA基因高可變區(qū)的擴(kuò)增

用細(xì)菌16SrDNA基因的通用引物擴(kuò)增16SrDNA基因高可變區(qū)片段，大小約390bp。引物分別為1055f和1406r－GC（其中f為正向引物；r為反向引物；GC是一段大小約40bp的富含GC的序列，其序列為5′－CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCC－3′）；引物序列分別為5′－ATGGCTGTCGTCAGCT－3′和5′－ACGGGCGGTGTGTAC－3′。

采用Touch Down PCR，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，退火45s，72℃延伸90s（退火溫度從60℃降至52℃，共20個(gè)循環(huán)），之后再進(jìn)行15個(gè)循環(huán)（94℃變性1min，55℃退火1min，72℃變性3min），72℃延伸10min，4℃終止。

1.4 變性梯度凝膠電泳

利用 DcodeTMUniversal Mutation Detection System（Bio－Rad）進(jìn)行DGGE分析。

細(xì)菌16SrDNA基因高變區(qū)的DGGE條件為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的聚丙烯酰胺凝膠，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%～60%的變性劑（100%的變性劑是濃度為7mol·L－1的尿素和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的去離子甲酰胺的混合物），上樣量為200ng，緩沖溶液為1×TAE，于60℃、160V下電泳3.5h。

電泳結(jié)束后，用10mg·mL－1EB染色15min，脫色，通過(guò)Bio－Rad凝膠成像系統(tǒng)成像，用Quantity One軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。

用聚丙烯酰胺凝膠回收試劑盒（日本Bioflux公司）回收其中的優(yōu)勢(shì)片段，再次用對(duì)應(yīng)的不帶“GC”的16SrDNA高可變區(qū)引物擴(kuò)增，然后按適當(dāng)比例連接到pMD19－T載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選插入片段正確的克隆，送至北京三博遠(yuǎn)志生物公司測(cè)序。

1.5 DNA片段序列分析

將所測(cè)的序列在GenBank中進(jìn)行相似性序列比對(duì)，以確定其進(jìn)化地位和親緣關(guān)系，序列差異小于3%的被認(rèn)為屬于同一種系型，采用Clustal X 1.8進(jìn)行序列比對(duì)，用 Mega 3.1軟件中的 Neighbor－joining算法進(jìn)行各序列間的同源性和進(jìn)化距離的分析和比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 薩Ⅲ組二類油層細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的DGGE分析

細(xì)菌用引物1055f和1406r－GC擴(kuò)增到16SrDNA基因高可變區(qū)，作為DGGE的樣品，上樣量為200ng，DGGE圖譜如圖1所示。

圖1 細(xì)菌16SrDNA基因高可變區(qū)DGGE圖譜Fig.1 DGGE Profiles of the high various region of 16SrDNA in bacteria

將圖1中所標(biāo)注的各個(gè)條帶回收，經(jīng)克隆后測(cè)序得到各條帶的序列信息，然后在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，獲得與其親緣關(guān)系最近的序列及所代表的細(xì)菌種屬信息。用 Clustal X 1.8和 Mega 3.1進(jìn)行各序列間的同源性和進(jìn)化距離的分析與比較，以Neighbor－joining連接方式構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖2所示。

從DGGE圖譜（圖1）和系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）可以看出，5口注水井中檢測(cè)出的細(xì)菌主要是屬于γ－變形菌綱的 Acinetobacter（Band 2h）、Pseudomonas（Band 1h、6h）、Enterobacteriaceae（Band 7h、8h、10h、11h）以及少量的Bacillus（Band 14h），屬于β－變形菌綱的Thauera（Band 15h）和 Hydrogenophaga（Band 16h）。主要優(yōu)勢(shì)菌群為α－變形菌綱（8.56%）、β－變形菌綱（9.62%）、γ－變形菌綱（19.15%）、網(wǎng)團(tuán)菌門（3.18%）、壁厚菌門（3.19%）、梭桿菌門（1.60%）和未培養(yǎng)細(xì)菌（67.90%）。

圖2 16SrDNA基因高可變區(qū)序列DGGE所代表的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the DGGE bands in 16SrDNA high various region

9口采油井中檢測(cè)出的細(xì)菌主要是屬于β－變形菌綱的Azoarcus（Band 17h、19h）、Thauera（Band 18h、20h、22h、36h）和Petrobacter（Band 26h），γ－變形菌綱的Pseudomonas（Band 25h、27h）、Acinetobacter（Band 2h）和Escherichia（Band 23h），ε－變形菌綱的Acobacter（Band 34h）以及Chloroflexi（Band 35h）。優(yōu)勢(shì)菌群為ε－變形菌綱（2.71%）、β－變形菌綱（3.26%）、壁厚菌門（3.25%）和未培養(yǎng)細(xì)菌（90.24%）。

5口注水井的菌群結(jié)構(gòu)相似，應(yīng)該是由于采出液長(zhǎng)期回注，使注水井中的細(xì)菌種類趨于穩(wěn)定。其中3種優(yōu)勢(shì)菌群也都是油藏中常見的細(xì)菌種屬，推測(cè)可能是采油井從注水井中帶出的采出液，且能適應(yīng)外界開放環(huán)境的油藏內(nèi)源細(xì)菌。9口采油井之間細(xì)菌群落的差異較大，優(yōu)勢(shì)菌群也不盡相同。B1－2－P30和B1－2－P130這2口中心井的細(xì)菌種類相似，但是數(shù)量有差別，主要的優(yōu)勢(shì)菌群是Thauera、Petrobacter、Escherichia、Pseudomonas以及未培養(yǎng)細(xì)菌。

在注采井中檢測(cè)到的優(yōu)勢(shì)菌群Acinetobacter、Pseudomonas和Thauera均是油藏中常見的細(xì)菌，其最適宜生長(zhǎng)溫度為33～45℃，一些菌株具有產(chǎn)表面活性劑、乳化原油、降解長(zhǎng)鏈烷烴的功能。其中Thauera是兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌，具有反硝化能力，在以乙酸鹽、丙酸鹽和乙醇等進(jìn)行硝化作用時(shí)可降解多環(huán)芳烴類物質(zhì)，在廢水處理中應(yīng)用較多。Pseudomonas屬的某些菌種具有烴降解功能，有的還可以產(chǎn)生生物表面活性劑和一些小分子物質(zhì)。Acinetobacter的某些菌種可產(chǎn)生生物表面活性劑，在采油中也有很好的應(yīng)用。上述菌屬中的優(yōu)勢(shì)菌群對(duì)于采油具有非常重要的意義[16］。

2.2 薩Ⅲ組二類油層細(xì)菌群落的多樣性

細(xì)菌文庫(kù)反映了細(xì)菌群落組成及占主要地位的細(xì)菌種類。分別對(duì)注水井 B1－330－P41和采油井 B1－2－P130中的微生物多樣性進(jìn)行分析，建立了16SrDNA克隆文庫(kù)。其中注水井獲得83個(gè)操作分類單元（OTUs）、采油井獲得22個(gè)操作分類單元（OTUs），兩者獲得的細(xì)菌文庫(kù)覆蓋率分別為65.60%和92.93%，庫(kù)容值較大，覆蓋程度高，具有較好的代表性[14］。注水井的細(xì)菌Shannon－Wiener多樣性指數(shù)為0.9615，高于采油井的0.7666，表明注水井的細(xì)菌多樣性高于采油井。原因可能是，在聚合物驅(qū)后的油藏環(huán)境中，隨著注入水進(jìn)入油藏，部分細(xì)菌因油藏孔道的截留或不適應(yīng)厭氧環(huán)境而死亡，只有部分種屬的細(xì)菌存留下來(lái)，因而采油井中的細(xì)菌多樣性有所降低。注入水和采出液樣品中細(xì)菌16SrDNA克隆文庫(kù)分析結(jié)果見表1 。

表1 注入水和采出液樣品中細(xì)菌16SrDNA克隆文庫(kù)分析結(jié)果Tab.1 The 16SrDNA gene clone libraries analysis of bacteria in injection water and production liquor samples

從表1 可明顯看出，可培養(yǎng)細(xì)菌Thauera、Syntrophotherms lipocalidus、Clostridium 和Syntrophus僅占樣品中16SrDNA克隆文庫(kù)的4.88%，其余94.54%為未培養(yǎng)細(xì)菌，這表明未培養(yǎng)細(xì)菌在聚合物驅(qū)后油藏的微生物群落結(jié)構(gòu)中起到重要作用[17］。

3 結(jié)論

（1）在聚合物驅(qū)后的薩Ⅲ組二類油層中，注水井、采油井檢測(cè)的細(xì)菌主要優(yōu)勢(shì)菌群為α－、β－、γ－、ε－變形菌綱以及少量的網(wǎng)團(tuán)菌門、壁厚菌門和梭桿菌門等，未培養(yǎng)細(xì)菌在注水井、采油井中所占比例較大，分別為67.90%（注水井）和90.24%（采油井）。

（2）在聚合物驅(qū)后的薩Ⅲ組二類油層中，注水井的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)相似，采油井之間的細(xì)菌菌群差異較大，優(yōu)勢(shì)菌群也不盡相同，其中Pseudomonas、Acinetobacter和Thauera 3種優(yōu)勢(shì)菌群在注水井、采油井中均被檢測(cè)到。

（3）聚合物驅(qū)后注水井B1－330－P41和采油井B1－2－P130的細(xì)菌克隆文庫(kù)分別獲得83個(gè)和22個(gè)操作分類單元，庫(kù)容值較大，覆蓋率高，具有較好的代表性。兩者對(duì)應(yīng)的Shannon－Wiener多樣性指數(shù)分別為0.9615和0.7666，表明聚合物驅(qū)后薩Ⅲ組二類油層中注水井的細(xì)菌多樣性高于采油井。

[1]閏亞茹，李瑞升，吳蔚.薩中地區(qū)二類油層聚合物驅(qū)油試驗(yàn)的幾點(diǎn)認(rèn)識(shí)[J］.大慶石油地質(zhì)與開發(fā)，2004，23（4）：87－88.

[2]宋曉彬.分流河道砂體層內(nèi)聚驅(qū)吸水剖面變化特征[J］.大慶石油地質(zhì)與開發(fā)，2010，29（4）：145－148.

[3]蔣焱，曹功澤，趙鳳敏，等.聚合物驅(qū)后微生物提高采收率的可行性分析[J］.油氣地質(zhì)與采收率，2008，15（5）：63－65.

[4]石梅.聚合物驅(qū)后利用微生物進(jìn)一步提高采收率的可行性[J］.大慶石油地質(zhì)與開發(fā)，2004，23（2）：56－58.

[5]王鳳蘭，王曉東.油藏微生物群落分布及提高采收率的模擬實(shí)驗(yàn)研究[J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2007，13（6）：859－862.

[6]代學(xué)成，王紅波，許念，等.內(nèi)源微生物驅(qū)油激活配方篩選評(píng)價(jià)指標(biāo)探討[J］.油氣地質(zhì)與采收率，2012，19（2）：37－40.

[7]谷峻，石成芳，吳曉磊，等.油藏微生物群落研究的方法學(xué)[J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，27（1）：323－328.

[8]黃永紅，袁紅梅，伍曉林，等.大慶油田低滲透油藏微生物群落結(jié)構(gòu)解析[J］.大慶石油學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，33（4）：63－66.

[9]張雪梅，佘躍惠，黃金鳳，等.大慶油田聚合物驅(qū)后油藏微生物多樣性研究[J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2008，14（5）：668－672.

[10]艾明強(qiáng)，李慧，劉曉波，等.大慶油田油藏采出水的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，21（4）：1014－1020.

[11]Nazina T N，Grigorian A A，Sue K F，et al.Phylogenetic diversity of aerobic saprotrophic bacteria isolated from the Daqing Oilfield[J］.Microbiology，2002，71（1）：103－110.

[12]吳亞嫚，谷峻，譚燕，等.油井采出液中微生物群落結(jié)構(gòu)的TRFLP分析[J］.土壤學(xué)報(bào)，2009，46（5）：878－886.

[13]趙玲俠，高配科，曹美娜，等.大慶聚驅(qū)后油藏內(nèi)源微生物群落結(jié)構(gòu)解析與分布特征研究[J］.環(huán)境科學(xué)，2012，33（2）：625－632.

[14]佘躍惠，張凡，向廷生，等.PCR－DGGE方法分析原油儲(chǔ)層微生物群落結(jié)構(gòu)及種群多樣性[J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，25（2）：238－242.

[15]程海鷹，肖生科，汪衛(wèi)東，等.變性梯度凝膠電泳方法在內(nèi)源微生物驅(qū)油研究中的應(yīng)用[J］.石油學(xué)報(bào)，2005，26（6）：82－85.

[16]夏晶晶，佘躍惠，張雪梅，等.大慶油田聚合物驅(qū)后產(chǎn)生物表面活性劑本源菌研究[J］.長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，5（1）：166－169.

[17]郭斌，吳曉磊，錢易.提高微生物可培養(yǎng)性的方法和措施[J］.微生物學(xué)報(bào)，2006，46（3）：504－507.