乙醇脫氫酶底物分子對接的優(yōu)化

黃可君，張光亞

（華僑大學 化工學院，福建 廈門361021）

乙醇脫氫酶（EC 1.1.1.1，ADHs）分布廣泛，目前從多種生物中均可分離得到［1］.來源于微生物的乙醇脫氫酶吸引了更多研究者關(guān)注，這是由于它能用于合成或修飾一些高價值的醇類物質(zhì)，尤其是一些手性醇類物質(zhì)［2-3］.乙醇脫氫酶能參與體內(nèi)的乙醇代謝，但是當攝入過多乙醇的時候，將大量消耗NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）生產(chǎn)NADH，導(dǎo)致肝臟甘油三磷酸酯的積累并抑制檸檬酸循環(huán)，最終導(dǎo)致代謝紊亂［4］.近年來，關(guān)于乙醇脫氫酶的研究越來越深入，ADH正在更加廣泛的應(yīng)用于工業(yè)、醫(yī)療以及科研中［5］.ADH主要以同型或異形二聚體的形式存在，有研究表明部分乙醇脫氫酶甚至有由二聚體聚合成為的更加復(fù)雜的四聚體結(jié)構(gòu)［4］.在人體中，乙醇脫氫酶可將底物氧化為醛，是一個氧化過程，而植物和細菌中的這一過程則恰好相反，其ADH催化的則是一個還原反應(yīng)［4］.分子對接對研究高級結(jié)構(gòu)尚不明晰蛋白質(zhì)的反應(yīng)機理具有明顯優(yōu)勢.有文獻報導(dǎo)，通過同源建模所得三維結(jié)構(gòu)，在木聚糖與底物可能結(jié)合的活性口袋部分以計算機模擬對接，可預(yù)測酶促反應(yīng)過程的關(guān)鍵氨基酸殘基［6］.如蓋偉等［7］利用Autodock程序篩選復(fù)方丹參方中HMG-CoA還原酶的抑制性成分；章媛等［8］利用分子對接與同源建模的方法對設(shè)計的化學藥物進行打分，這也是一種典型的利用分子模擬對接完成的藥物開發(fā)環(huán)節(jié).分子對接的結(jié)果對酶的定向改造及抑制劑開放均具有重要意義.基于此，本文通過分子對接的方法探尋其催化底物脫氫時酶與底物分子的特定位點間存在作用力及其與底物親和力之間的相關(guān)性.

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

使用的ADH源自Sulfolobussolfataricus，是一種極端嗜熱古菌［9］，屬雙亞基蛋白，每個單體具有一個酶蛋白、一個輔酶分子（NAD），以及兩個鋅離子.其中：兩個鋅離子功能不同，Zn400僅屬于結(jié)構(gòu)原子，Zn500則位于活性位點，對催化活性和對接結(jié)果具有顯著影響.相關(guān)的實驗數(shù)據(jù)均在0.1mol·L-1甘氨酸-NaOH緩沖液 （pH＝10.5，65℃）的條件下測定的［10］.

小分子一般沒有現(xiàn)成的PDB文件，所以文中底物分子的原始數(shù)據(jù)源自NCBI的Pubchem，并需要通過PRODRG2Server，轉(zhuǎn)為為PDB文件（http：∥davapc1.bioch.dundee.ac.uk/prodrg／）.圖1為選用的15種底物小分子結(jié)構(gòu)，表1為其相應(yīng)的催化能力參數(shù)［10］.表1中：Km為抗體與底物結(jié)合的解離平衡常數(shù)（米氏常數(shù)）；Kcat為抗體酶存在時的轉(zhuǎn)換速率；CID為化合物的編號.

圖1 15種底物分子的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of the 15substrates

表1 對不同底物催化能力參數(shù)表Tab.1 Catalytic capacity parameters with all substrates

1.2 模擬方法

采用的分子對接方式：a）單亞基酶蛋白與底物分子對接；b）單亞基酶蛋白+輔酶與底物對接；c）單亞基酶蛋白+輔酶+鋅離子（位于活性位點的Zn500）與底物進行對接.由于要進行Gasteiger加電計算，要求小分子底物必須提前做過能量最小化且加上所有氫.此過程可在PRODRG2Server生成pdb文件時完成.在對接條件的選擇中，將蛋白質(zhì)分子作為剛性分子考慮，并且不合并非極性氫.由于所下載的PDB文件本身就帶有輔酶NAD及底物，故可通過計算PDB文件中底物分子的中心來估算活性位點的坐標.

GridBox的設(shè)定將明顯影響到分子的對接效果，故設(shè)定的GridBox需遵守以下的2個原則：1）確?；钚晕稽c周邊基團都能納入GridBox，這是底物正確對接的基本保證；2）設(shè)定盡可能小的GridBox，有效對接的比例將大大增加.在保持模擬次數(shù)不變的條件下，有效對接次數(shù)的增加將使最佳對接模型更接近實際情況.綜合考慮底物分子中心及分子口袋位置，選?。?0.389，16.766，15.254）作為中心點.其中：X，Y，Z軸的長度單位分別取40，42，40，晶格大小定義為3.75×10-11m.使用的軟件為Autodock 4.2小分子三維建模軟件.

2 結(jié)果與分析

2.1 輔酶對分子對接結(jié)果的影響

當僅使用酶蛋白與底物進行對接的時候，底物分子被對接在原來酶蛋白與NAD相作用的位點，如圖2所示.由此可以推斷后者的對接是沒有意義的 .小分子與酶蛋白的對接結(jié)果，如圖3所示 .圖3中：E為分子勢能 .對比圖3的實驗數(shù)據(jù)可知：對接結(jié)果所得的各參數(shù)與實驗測定的Km值沒有相關(guān)性，其r值僅為0.13，而p值為0.63，遠遠大于所要求的小于0.05的值.

圖2 小分子與酶蛋白的錯誤對接Fig.2 Error docking result of the substrates with zymoprotein

實驗解析出的底物分子、輔酶和鋅離子緊緊相鄰而互不重疊，它們共同位于分子最大的一個溝，輔酶恰好填補了溝內(nèi)的深處空間，而鋅離子附近則位于酶的活性位點附近.輔酶存在時，小分子能正確地對接在靠近口袋出口的地方；而缺少NAD時，小分子則向口袋縱深漂移（圖2）.

2.2 鋅離子對分子對接結(jié)果的影響

Zn離子并不會通過占據(jù)空間的方式阻止地位結(jié)合到錯誤的位點，相反，它起到了一個吸引的作用，能降低底物分子漂出活性口袋的概率.圖4為小分子與全酶的對接結(jié)果，表2為不同對接方式的r值.從圖3，4和表2的對接結(jié)果可以看出：帶有鋅離子的全酶比不帶有鋅離子的酶的對接結(jié)果與實驗值具有更高的相關(guān)性.Hu等［11］研究也顯示，鋅離子在總的結(jié)合能中貢獻了相當大的一部分.這就解釋了為什么沒有鋅離子的時候也能正確對接，而對接位點的專一性會下降.鋅離子能夠起到一個穩(wěn)定體系的作用，具體表現(xiàn)為當缺少鋅離子的時候，對接結(jié)果的RMSD值顯著上升［12］.

圖3 小分子與酶蛋白的對接結(jié)果Fig.3 Docking result of the substrates with zymoprotein

圖4 小分子與全酶的對接結(jié)果 Fig.4 Docking result of the substrates with holoenzyme

由于Autodock默認將均方根偏差（RMSD）值相差在2以內(nèi)的對接結(jié)果歸于同一組，RMSD值的上升將導(dǎo)致對接結(jié)果的分組明顯增多.因此從對接結(jié)果來看，其分組數(shù)目與RMSD值一樣，都是體現(xiàn)體系穩(wěn)定性的一個重要指標.對接的結(jié)果表明該乙醇脫氫酶是鋅離子依賴性的，這與相關(guān)文獻的研究結(jié)果是一致的［13］.引入NAD及Zn以后，數(shù)據(jù)的相關(guān)性就大大增強了，r值為0.63，p值為0.01，模型達到極顯著相關(guān)性 .此外，RMSD值的變化也趨于變小，表現(xiàn)為分組變少或?qū)咏Y(jié)果更加集中于第一組，證明體系的穩(wěn)定性是因為引入輔酶和輔基而顯著增強的.

表2 不同對接方式的r值Tab.2 r-value of different docking ways

圖5為正確的分子對接結(jié)果.圖5顯示了底物分子，NAD和Zn三者的相對位置，是通過實驗解析所得出的空間關(guān)系.為了更清晰地顯示小分子，NAD和Zn，以不同的顯示方式來表示不同分子.從圖5可以發(fā)現(xiàn)：底物分子，NAD和Zn三者都被包埋在分子的同一深溝，底物分子位于此深溝的最外區(qū).

圖5 小分子與全酶的相對位置Fig.5 Relative position of the substrates with holoenzyme

從以上數(shù)據(jù)可以得出如下3點結(jié)論：1）底物與酶進行對接的過程中，輔酶和金屬離子對于酶活性的保持是不可或缺的，它們的存在與否大大影響到對接的可靠性；2）當只使用酶蛋白與底物進行分子對接的時候，所得數(shù)據(jù)與實驗值無任何相關(guān)性；3）與酶蛋白對接的在原始數(shù)據(jù)中，各獨立實驗的RSMD值變化很大，證明對接的專一性很差.有文獻表明［4］，小分子沒有直接同酶蛋白相互作用，而是與酶-金屬離子復(fù)合體相互作用，對接所得的數(shù)據(jù)恰恰佐證了這一點.從圖3，4和表2的R值可以看出：當NAD和Zn同時存在的時候，數(shù)據(jù)的相關(guān)性更強.

2.3 其他因素對分子對接結(jié)果的影響

經(jīng)過對對接結(jié)果的分析，發(fā)現(xiàn)單個氫鍵的鍵能、鍵長并不會對對接結(jié)果的打分造成明顯影響.所有有效的對接結(jié)果中均存在相同的氫鍵（由第40位的Ser（絲氨酸）與底物分子中的氧原子形成）.然而，錯誤的對接結(jié)果則可能含有更多的氫鍵（3～4個氫鍵），這表明氫鍵的數(shù)量對分子的結(jié)合有明顯的影響，氫鍵越多，分子間結(jié)合越穩(wěn)定.只有形成有效的氫鍵才是正確的對接結(jié)果，且只有正確的空間位置才能保證酶的催化活性.除了位點空間位的互補、靜電相互作用和氫鍵以外，溶解熵也對穩(wěn)定受體-配體復(fù)合物起著重要的作用［14］.

需要注意的是，對接時虛擬的環(huán)境與實驗的測定環(huán)境不同，目前的對接程序尚無法提供具體的離子強度、溫度等參數(shù)的設(shè)定.實際試驗中，體系的離子強度、離子種類以及溫度都能影響到酶與底物的結(jié)合情況.例如，Sulfolobussolfataricus是一種超高溫菌［9］，故實驗使用的數(shù)據(jù)是在0.1mol·L-1甘氨酸-NaOH緩沖液（pH＝10.5，65℃）的條件下測定的［10］.Autodock對條件進行了簡化和近似處理，在計算能量時將體系溫度設(shè)定為298.15K（25℃），而pH值及離子強度和種類也難以設(shè)定.有文獻顯示，溫度，pH值和金屬離子對乙醇脫氫酶的活性均有顯著影響［15］.綜上所述，這樣的條件差別會明顯影響到分子對接的準確性及其與實驗數(shù)據(jù)Km的相關(guān)性.

3 討論

分子對接結(jié)果能提供一個統(tǒng)計學上的參考，但當前的分子對接選算法不可能替代傳統(tǒng)實驗.雖然分子對接的結(jié)果并不能十分精確反應(yīng)底物與蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)果，分子結(jié)合力的強弱也不能完全反映酶活性的大?。ㄟ^高的結(jié)合力將使得酶促反應(yīng)的效果變差）［16］.但值得一提的是，分子對接的結(jié)果具有明顯的統(tǒng)計學意義（結(jié)合力弱的一定不會是最佳底物），如果利用其結(jié)果進行初步篩選，將會極大節(jié)省時間和實驗成本.Richard［17］曾經(jīng)把350萬臺個人計算機連接起來，在幾天內(nèi)從數(shù)十億的類藥分子庫里篩選出目標蛋白質(zhì)的配體，而篩選出的數(shù)百個小分子經(jīng)測試約10%的小分子有活性.

對接結(jié)果表明：單獨的酶蛋白對接結(jié)果沒有統(tǒng)計學意義，證明了酶蛋白失去輔酶后確實不具有生物學活性.輔酶對于酶分子的活性具有至關(guān)重要的作用，對于乙醇脫氫酶來說，底物是同酶蛋白-輔酶復(fù)合體相互作用完成酶促反應(yīng)的.鋅離子則能夠給起到一個穩(wěn)定體系的作用，缺乏鋅離子將引發(fā)酶活性的降低.當然，文中分子對接環(huán)境與實驗中酶分子所處真實環(huán)境有所不同，這對分子對接結(jié)果與酶活性實驗結(jié)果的相關(guān)系數(shù)有可能有一定影響.

對于帶有輔酶或者金屬輔基的分子對接，欲預(yù)測某個特定酶對底物的生物活性，則必須將輔酶及金屬離子加入到對接體系中，否則對接的特異性和有效性將大打折扣，不能取得有參考意義的結(jié)果.對于不知道結(jié)合位點的盲目對接（blind docking）來說，金屬離子和輔酶的意義就更為重要了.底物分子與酶的對接結(jié)果并不能完全反映酶對底物的活性，因為酶活性不僅涉及底物與酶的結(jié)合，還涉及產(chǎn)物的離開，并且分子對接的過程中其理化參數(shù)會與生理狀態(tài)下有所不同.雖然分子對接的結(jié)果只能提供一個相對粗糙的、趨勢性的預(yù)測，但是確實能夠極大縮減實際實驗的成本，對提高實驗的效率和經(jīng)濟效益具有非凡的意義.

［1］ HIDEHIKO H，NORIHO K，YUTAKA K，et al.Properties of an alcohol dehydrogenase from the hyperthermophilic archaeonAeropyrumpernixK1［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2004，97（3）：202-206.

［2］ REID M F，F(xiàn)EWSON C A.Molecular characterization of microbial alcohol dehydrogenases［J］.Critical Reviews in Microbiology，1994，20（1）：13-56.

［3］ ZHANG J，DUETZ W A，WITHOLT B，et al.Rapid identification of new bacterial alcohol dehydrogenases for（R）-and（S）-enantioselective reduction ofβ-ketoesters［J］.Chemical Communications，2005，36（11）：2120-2121.

［4］ 鮑文娜.乙醇脫氫酶的克隆表達及生物活性分析［D］.杭州：浙江大學，2007：6-23.

［5］ 張曉霞，毛跟年，張云麗.乙醇脫氫酶應(yīng)用研究現(xiàn)狀［J］.動物醫(yī)學進展，2007，28（12）：92-95.

［6］ 林錦霞，張燎原，張光亞，等.計算機模擬短小芽孢桿菌木聚糖酶與底物木聚糖的對接［J］.生物工程學報，2007，23（4）：715-716.

［7］ GAI Wei，ZHANG Yan-ling，AI Lu，et al.Screening of HMG-CoA reductase inhibitors from composite salvia miltiorrhiza using autodock［J］.Chinese Journal of Natural Medicines，2010，8（1）：51-56.

［8］ 章媛，陳亞東.同源模建和分子對接研究 HDAC1／HDAC8的選擇性［J］.物理化學學報，2010，26（6）：1676-1686.

［9］ 祝偉，彭謙.超高溫菌酶構(gòu)象的剛性和熱穩(wěn)定性的相互關(guān)系［J］.生命的化學，2003，23（3）：187-190.

［10］ PENNACCHIO A，ESPOSITO L，ZAGARI A，et al.Role of tryptophan 95in substrate specificity and structural stability ofSulfolobussolfataricusalcohol dehydrogenase［J］.Extremophiles，2009，13（5）：751-761.

［11］ HU X，SHELVER W H.Docking studies of matrix metallo proteinase inhibitors：Zinc parameter optimization to improve the binding free energy prediction［J］.Journal of Molecular Graphics and Modelling，2003，22（2）：115-126.

［12］ 趙文娜，鄒建衛(wèi)，蔣勇軍，等.基于HPPK靶標酶的分子對接研究：金屬離子 Mg2+的影響［J］.化學學報，2005，63（5）：434-438.

［13］ RADIANINGTYASA H，WRIGHT P C.Alcohol dehydrogenases from thermophilic and hyperthermophilic archaea and bacteria［J］.FEMS Microbiology，2003，27（5）：593-616.

［14］ STODDARD B L，Jr KOSHLAND D E.Prediction of the structure of a receptor-protein complex using a binary docking method［J］.Nature，1992，358（27）：774-776.

［15］ 霍丹群，張云茹，侯長軍.Acetobacter Z127乙醇脫氫酶的純化及酶學性質(zhì)［J］.重慶大學學報：自然科學版，2006，29（4）：65-68.

［16］ PLEWCZYNSKI D，?AZNIEWSKI M，AUGUSTYNIAK R，et al.Can we trust docking results？Evaluation of seven commonly used programs on PDBbind database［J］.Journal of Computational Chemistry，2011，32（4）：742-755.

［17］ RICHARDS W G.From diatomics to drugs and dividends［J］.Journal of Molecular Graphics and Modelling，2007，26（3）：596-601.