針刺對(duì)血管性癡呆大鼠血清TNF－α、IL－1β及學(xué)習(xí)記憶能力的影響*

陳英華，孫忠人，金 弘，洪 霞，姜 磊，秦瑞奇，魏 巍，倪國(guó)忠

(1．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040;2．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040)

血管性癡呆(Vascular dementia，VD)是指因腦血管病導(dǎo)致的癡呆臨床綜合征，以反復(fù)發(fā)生缺血性卒中事件后出現(xiàn)癡呆、認(rèn)知功能突然減退或波動(dòng)樣、階梯樣進(jìn)展為特點(diǎn)［1］，其患病率大約占腦卒中幸存者中的1/3［2］。病程中同時(shí)存在與癡呆有關(guān)的腦血管性損害表現(xiàn)，如局灶性體征和癥狀。該病最終導(dǎo)致患者的日常生活能力減退和社會(huì)活動(dòng)能力逐漸喪失，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量，給患者及家庭、社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)［3－4］。目前尚無(wú) VD滿(mǎn)意的治療藥物和方法。VD的防治一直是醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。大量研究［5－7］表明，針刺療法能夠改善癡呆患者的記憶和生活能力。本研究在導(dǎo)師孫忠人教授的指導(dǎo)下，選擇與學(xué)習(xí)記憶能力有內(nèi)在聯(lián)系的相關(guān)因子為切入點(diǎn)，采用四血管阻斷法(4－VO)制作VD大鼠模型后，選取四神聰、風(fēng)池穴進(jìn)行針刺，觀察VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及檢測(cè)大鼠血清中TNF－α、IL－1β含量的變化，旨在探討針刺防治血管性癡呆的作用機(jī)制，為針刺防治VD提供進(jìn)一步的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

1．1．1 動(dòng)物 選用健康 SD雄性大鼠168只，2～3個(gè)月齡，體重(220±30)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將大鼠放入Morris水迷宮中進(jìn)行定位航行、空間探索學(xué)習(xí)訓(xùn)練，連續(xù)進(jìn)行5天，第6天進(jìn)行大鼠行為學(xué)檢測(cè)，選擇90 s內(nèi)找到平臺(tái)的大鼠備用，進(jìn)行水迷宮測(cè)試的168只大鼠全部符合條件。

1．1．2 儀器 電子天平(PL602－L)，梅特勒 －托利多儀器(上海)有限公司;大鼠腦立體定位儀SN－2，日本;Morris水迷宮(直徑150 cm，高60 cm;站臺(tái)規(guī)格:直徑12 cm，高25 cm)，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所;單極微手術(shù)電凝器(CHR)，武漢春光醫(yī)療美容儀器有限公司;自動(dòng)平衡微型離心機(jī)(LD24－0．8)，北京醫(yī)用離心機(jī)制造廠;電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(DY89 1型，寧波);分析振蕩器(FZQ 2型，江蘇);脈沖電療儀(KWD－808Ⅰ)，常州市武進(jìn)長(zhǎng)城醫(yī)療器械有限公司;攝像機(jī)(HDR－PJ200)，日本索尼公司;0．30 mm×13 mm“華佗牌”一次性針灸針，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司;Ht2型酶標(biāo)儀和洗板機(jī)，奧地利博塞。

1．1．3 試劑 IL－1β、TNF－α 酶聯(lián)免疫試劑盒，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 動(dòng)物分組 將168只大鼠隨機(jī)分為正常組24只、假手術(shù)組24只，剩余的120只作為備用采用國(guó)際公認(rèn)的Pulsinelli四血管阻斷法(4－VO)制作VD大鼠模型。其中造模期間死亡48只，存活72只。將模型制作成功大鼠72只隨機(jī)分為模型組、手針組、電針組，每組24只。共計(jì)5大組，每組分別于造模后7天、14天、21天又分為3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各觀察8只。

1．2．1 VD模型的建立 采用國(guó)際公認(rèn)的Pulsinelli四血管阻斷法(4－VO)制作 VD大鼠模型［8］。術(shù)前12 h禁食、禁水。以10%水合氯醛(0．4 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，將大鼠伏臥固定于固定臺(tái)上，消毒，行背側(cè)頸正中切口，逐層鈍性分離暴露雙側(cè)第1頸椎橫突翼小孔，用直徑為0．5 mm的電凝針插入每側(cè)翼小孔燒灼雙側(cè)的椎動(dòng)脈，造成永久性閉塞。在手術(shù)部位施以適量青霉素抗感染。24 h后再將大鼠麻醉，仰臥固定，消毒，行腹側(cè)頸正中切口，鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，以“4”號(hào)絲線穿線牽拉頸總動(dòng)脈，用微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈5 min，共夾閉3次，每次間隔1 h。術(shù)后手術(shù)部位施以適量青霉素對(duì)抗感染，然后縫合，常規(guī)飼養(yǎng)觀察，每天每只肌肉注射青霉素8萬(wàn)U，連續(xù)7天，以防感染。

1．2．2 干預(yù)方法 ①正常組:不造模，不針刺。②假手術(shù)組:背側(cè)頸正中切口，分離雙側(cè)椎動(dòng)脈，不阻斷血流;頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不夾閉血管;抗炎后直接縫合，不針刺。③模型組:只造模，不針刺。④手針組:造模7天后即開(kāi)始針刺，腧穴選取參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［9］取左右神聰、雙側(cè)風(fēng)池穴。操作方法:用0．30 mm×13 mm華佗牌毫針針刺左右神聰穴，平刺2．5 mm，雙側(cè)風(fēng)池穴，向后下方斜刺5 mm，持續(xù)捻轉(zhuǎn)5 min后留針，針刺治療每日1次，每次30 min。分別于治療7天、14天、21天后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行行為學(xué)及各觀察指標(biāo)測(cè)試。⑤電針組:造模7天后即開(kāi)始針刺，選取左右神聰、雙側(cè)風(fēng)池穴。具體方法:用0．30 mm× 13 mm華佗牌毫針針刺左右神聰穴，向百會(huì)平刺2．5 mm，雙側(cè)風(fēng)池穴，向后下方斜刺5 mm，然后連接長(zhǎng)城牌KWD－808Ⅰ型脈沖電療儀，分別連接同側(cè)的神聰穴、風(fēng)池穴，正極在上，負(fù)極在下，施以連續(xù)波，電壓2 V，頻率為2 Hz，電流100 μA，強(qiáng)度以肢體微顫為度，針刺治療每日1次，每次30 min。

1．2．3 行為學(xué)檢測(cè) 通過(guò)Morris水迷宮檢測(cè)大鼠的行為學(xué)習(xí)記憶能力。Morris水迷宮由圓形不銹鋼的水池、平臺(tái)、自動(dòng)記錄系統(tǒng)、供水系統(tǒng)四部分組成，水池直徑150 cm，高60 cm，水深26 cm，水溫保持在(24±1)℃，池壁標(biāo)明4個(gè)等距離入水點(diǎn)，為試驗(yàn)起始點(diǎn)，由此將水池等分為4個(gè)象限，任選其中1個(gè)象限，正中放置1個(gè)直徑12 cm、高25 cm的平臺(tái)，迷宮上方裝有攝像機(jī)，并和錄像機(jī)以及計(jì)算機(jī)顯示器連接，自動(dòng)錄入大鼠游泳軌跡進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)時(shí)以水面稍微漫過(guò)平臺(tái)1 cm為宜。通過(guò)初篩，進(jìn)行水迷宮測(cè)試的168只大鼠全部符合條件。并分別于造模前、造模后7天、針刺治療第7天、第14天、第21天的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。

1．2．4 大鼠血清TNF－α、IL－1β 含量測(cè)定 分別于針刺治療第7天、第14天、第21天的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)結(jié)束進(jìn)行水迷宮測(cè)試完畢后，經(jīng)心臟取血，靜置2 h，2500轉(zhuǎn)/min離心10 min，分離血清，置－20℃冰箱中備檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法(Elise)進(jìn)行IL－1β、TNF－α測(cè)定，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1．2．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18．0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以xˉ±s表示。同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)采用單因素方差分析，不同組之間同一時(shí)間點(diǎn)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．1．1 造模前后定位航行試驗(yàn) 造模前、后各組大鼠逃避潛伏期的比較，見(jiàn)表1。

表1 造模前、后各組大鼠逃避潛伏期的比較(ˉ±s，單位:s)

表1 造模前、后各組大鼠逃避潛伏期的比較(ˉ±s，單位:s)

組別 n 造模前 造模后正常組24 29．37 ±9．88 29．67 ±8．72假手術(shù)組 24 29．62 ±9．36 30．84 ±9．52模型組 24 29．09 ±9．99 42．54 ±6．11手針組 24 29．75 ±9．27 43．90 ±7．24電針組24 29．32 ±9．64 42．83 ±8．28

由表1可以看出，造模前各組大鼠定位航行試驗(yàn)逃避潛伏期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05)，且有可比性;造模后模型組、手針組、電針組大鼠與正常組、假手術(shù)組對(duì)比逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，差異有顯著性意義(P＜0.01)，說(shuō)明VD大鼠造模成功。

2．1．2 造模前后空間探索試驗(yàn) 造模前、后各組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)的比較，見(jiàn)表2。

表2 造模前、后各組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)的比較(ˉ±s，單位:次)

表2 造模前、后各組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)的比較(ˉ±s，單位:次)

組別 n 造模前 造模后正常組24 5．21 ±0．83 5．13 ±0．90假手術(shù)組 24 5．21 ±1．02 4．67 ±0．64模型組 24 5．17 ±1．20 2．50 ±0．59手針組 24 5．17 ±0．92 2．50 ±0．59電針組24 5．17 ±0．82 2．63 ±0．77

由表2可以看出，造模前各組大鼠空間探索試驗(yàn)穿越平臺(tái)次數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05)，且有可比性;造模后模型組、手針組、電針組大鼠與正常組、假手術(shù)組對(duì)比穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，差異有顯著性意義(P＜0．01)，說(shuō)明VD大鼠造模成功。

2．1．3 治療后各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期比較見(jiàn)表3。

表3 治療后各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期比較(±s，單位:s)

表3 治療后各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期比較(±s，單位:s)

注:與正常組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;與假手術(shù)組比較，★P ＜0．05，★★P ＜0．01;與模型組比較，▲P ＜0．05，▲▲P ＜0．01。

組別 n 7天 14天 21天正常組 8 28．93 ±9．10▲▲ 29．95 ±10．25▲▲ 31．54 ±8．62▲▲假手術(shù)組 8 30．00 ±9．98▲▲ 31．05 ±8．79▲▲ 31．47 ±10．96▲▲模型組 8 46．11 ±10．45＊＊★★54．01 ±13．21＊＊★★ 73．97 ±8．66＊＊★★手針組 8 40．56 ±8．30＊＊★ 38．22 ±4．60▲▲ 35．88 ±4．04▲▲電針組 8 38．30 ±4．70* 35．03 ±4．03▲▲ 30．65 ±3．70▲▲

由表3可以看出，針刺治療后，與同一時(shí)間點(diǎn)的模型組相比，手針組、電針組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，差異有顯著性意義(P＜0．01);同一時(shí)間點(diǎn)，電針組較手針組的逃避潛伏期明顯縮短，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。說(shuō)明針刺可以改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶成績(jī)，電針組顯著。

2．1．4 治療后各組VD大鼠不同時(shí)間點(diǎn)穿越平臺(tái)次數(shù)的變化比較 見(jiàn)表4。

表4 治療后各組VD大鼠不同時(shí)間點(diǎn)穿越平臺(tái)次數(shù)的變化比較(ˉx±s，單位:次)

由表4可以看出，針刺治療后，與同一時(shí)間點(diǎn)的模型組相比，手針組、電針組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增 多，差異有顯著性意義(P＜0．05或P＜0．01);與同一時(shí)間點(diǎn)的手針組相比，電針組大鼠的穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增多，差異有顯著性意義(P＜0．05)。說(shuō)明針刺可以改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶成績(jī)，電針組更為顯著。

2．2 治療后各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清TNF－α、IL－1β含量變化比較

表5 治療后各組大鼠血清TNF－α含量變化(ˉ±s，n=8，單位:ng/L)

表5 治療后各組大鼠血清TNF－α含量變化(ˉ±s，n=8，單位:ng/L)

注:與正常組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;與假手術(shù)組比較，★P ＜0．05，★★P ＜0．01;與模型組比較，▲P ＜0．05，▲▲P ＜0．01。

組別 7天 14天 21天正常組 16．77±1．65▲▲ 16．77 ±1．65▲▲ 16．77±1．65▲▲假手術(shù)組18．20 ±2．76▲▲ 18．45 ±2．37▲▲ 18．39 ±2．36▲▲模型組 31．43 ±3．21＊＊★★ 34．05 ±4．54＊＊★★ 42．36 ±3．74＊＊★★手針組 22．89±3．26＊＊★★▲▲23．85 ±2．46＊＊★★▲▲22．94±3．44＊＊★★▲▲電針組 20．99 ±2．56＊＊★▲▲ 20．88 ±3．26＊＊▲▲ 22．92 ±3．76＊＊★★▲▲

由表5可以看出，針刺治療后，同一時(shí)間點(diǎn)的手針組、電針組大鼠血清TNF－α含量明顯下降，與模型組相比較，差異有顯著性意義(P＜0．01)。說(shuō)明針刺可以降低VD大鼠的TNF－α含量，電針組較顯著。

表6 治療后各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清IL－1β含量變化(ˉx±s，n=8，單位:ng/L)

由表6可以看出，針刺治療后，同一時(shí)間點(diǎn)的手針組、電針組大鼠血清IL－1β含量顯著降低，與模型組相比較，差異有顯著性意義(P＜0.01)，說(shuō)明針刺可以降低VD大鼠的IL－1β含量，電針組較顯著。

3 討論

由于大鼠的腦血管分布與人類(lèi)酷似，國(guó)內(nèi)外常采用SD大鼠或Wistar大鼠，利用二血管阻斷法(2－VO)、三血管阻斷法(3－VO)或四血管阻斷法(4－VO)建立VD動(dòng)物模型。雖然4－VO手術(shù)較復(fù)雜，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中4－VO死亡機(jī)率較高，但實(shí)驗(yàn)操作的熟練程度直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果［10］。由于4－VO為目前國(guó)際公認(rèn)的VD造模方法，它可高度模擬VD的發(fā)病特點(diǎn)，且缺血后生理指標(biāo)穩(wěn)定，不影響缺血后結(jié)果，病理改變較為充分、明確，無(wú)明顯肢體運(yùn)動(dòng)障礙，病理?yè)p傷接近人急性腦缺血的變化。通過(guò)行為學(xué)檢查驗(yàn)證，造模后大鼠可以達(dá)到VD模型的標(biāo)準(zhǔn)。因此，筆者采用四血管阻斷法(4－VO)建立VD動(dòng)物模型。

血管性癡呆屬中醫(yī)學(xué)的“癡呆”、“呆病”、“神志病”等范疇。經(jīng)云:“頭者，精明之府也”，“腦為髓海”、“腦為元神之府”，“頭者，諸陽(yáng)之會(huì)，上丹于泥宮，百神所聚”?！夺t(yī)學(xué)心悟》有“腎主智，腎虛則智不足”之說(shuō)。這些說(shuō)明神明智能與腦、腎有關(guān)。本病病因病機(jī)是腎虛髓虧、痰瘀閉阻腦絡(luò)，屬本虛標(biāo)實(shí)之證，而出現(xiàn)智能衰退及情志異常等表現(xiàn)。針灸治療VD有一定的療效［10］。本研究是在傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)理論及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論的指導(dǎo)下，結(jié)合導(dǎo)師多年的臨床經(jīng)驗(yàn)完成的，運(yùn)用電針刺激四神聰和風(fēng)池穴治療VD。四神聰為百會(huì)穴前后左右各一寸處，屬經(jīng)外奇穴，同為各經(jīng)脈之氣會(huì)聚之處，功如其名，針之能調(diào)節(jié)陰陽(yáng)，有寧心安神、明目聰耳、醒腦益智的功效。《太平圣惠方》云:“神聰四穴，理頭風(fēng)目眩，狂亂瘋癲癇，針入三分?！憋L(fēng)池具有平肝熄風(fēng)、清頭明目、醒腦安神作用，為治風(fēng)之要穴。風(fēng)池穴首載于《靈樞·熱病》，屬足少陽(yáng)膽經(jīng)穴位，膽主決斷，在精神思維活動(dòng)中具有判斷事物做出決定的作用。已經(jīng)研究表明，風(fēng)池穴治療中風(fēng)療效肯定。本組研究所選風(fēng)池穴可以通過(guò)改善椎－基底動(dòng)脈系統(tǒng)而改善腦部血液循環(huán)，改善腦的代謝，間接抑制癡呆的發(fā)展，維持殘存的腦功能。四神聰穴可以活化大腦皮質(zhì)細(xì)胞，改善腦功能，減輕因癡呆而產(chǎn)生的各種癥狀。兩穴通電后患者有頭清目明、精力充沛之感。其機(jī)制可能是脈沖電流通過(guò)上行網(wǎng)狀激活系統(tǒng)使大腦細(xì)胞得到活化，皮質(zhì)的興奮性增高;同時(shí)，基底動(dòng)脈供血增多，使腦血流量增多，從而思維活躍［11］。

隨著分子生物學(xué)、分子免疫學(xué)的深入發(fā)展，炎癥反應(yīng)機(jī)制在腦缺血中的作用越來(lái)越受到重視。大量證據(jù)表明，腦缺血后的炎癥反應(yīng)與缺血后的繼發(fā)性腦損傷密切相關(guān)。腦組織缺血后伴隨著一系列的炎癥反應(yīng)，而VD主要與缺血性腦血管病有關(guān)。腦缺血后以IL－1β和TNF－α為代表的炎性細(xì)胞因子參與了機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，且在發(fā)病后數(shù)天至1周內(nèi)占主導(dǎo)作用。無(wú)論是炎性細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá)，還是其誘發(fā)的其它活性物質(zhì)的過(guò)度表達(dá)，都將使反應(yīng)向不利于機(jī)體的方向發(fā)展。這些炎性細(xì)胞在健康成人體內(nèi)含量很低，腦缺血后體內(nèi)IL－1β和TNF－α的表達(dá)迅速增加，啟動(dòng)多種細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)多種途徑損傷神經(jīng)元功能，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)證明，若用IL－1抗體、TNF－α抗體進(jìn)行干預(yù)，腦缺血病灶可以縮小，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

本研究發(fā)現(xiàn)造模后大鼠表現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙，針刺治療后可以縮短VD大鼠逃避潛伏期、增加VD大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)。TNF－α、IL－1β在VD大鼠 血清中的表達(dá)均較正常組增高，針刺治療后顯著降低，表明針刺對(duì)VD的腦保護(hù)作用是通過(guò)抑制VD大鼠腦內(nèi)炎癥這一途徑實(shí)現(xiàn)的。

總之，針刺四神聰、風(fēng)池后能縮短VD大鼠水迷宮逃避潛伏期、增加VD大鼠水迷宮穿越平臺(tái)次數(shù)以及降低VD大鼠血清TNF－α、IL－1β的含量，抑制缺血所致的炎性細(xì)胞因子釋放，減輕神經(jīng)細(xì)胞的炎性損傷，從而改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，并且電針更為顯著，為臨床針刺治療VD提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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