肺炎球菌莢膜多糖對(duì)人體免疫應(yīng)答狀態(tài)的初步研究

李圓菲，鄭曉斌，周文英，黃 瑾＊

（1．長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，湖南 長(zhǎng)沙410008；2．中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣東 珠海519000）

肺炎球菌一直是全球范圍肺部感染最常見的致病菌，占社區(qū)獲得性肺炎的第一位，肺炎鏈球菌肺炎是引起成年人CAP（Community Acquired Pneumonia，社區(qū)獲得性肺炎）最常見的病因，被認(rèn)為是人類的重要致病菌，波及范圍極廣，在歐洲和美國(guó)占需住院CAP患者的30%－50%［1］，在我國(guó)年齡大于60歲的老年人中為33．4%，兒童占38．2%［2－3］。嚴(yán)重危害人類健康。肺炎球菌為革蘭陽(yáng)性雙球菌，莢膜多糖為其主要的致病因子，根據(jù)其莢膜不同的組成成分，定義出91種血清型。PPV23（Pneumococcal Polysaccharide Vaccine 23，23價(jià)莢膜多糖肺炎球菌莢膜多糖疫苗），這種疫苗是0．5ml中包括了23種血清型提純的肺炎球菌莢膜多糖，這23種血清型為1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、20、22F、23F和33F，每種血清型25μg，這些血清型涵蓋了美國(guó)和其他一些發(fā)達(dá)國(guó)家成年人侵襲性肺疾病的85%－90%，并包括了大多數(shù)耐藥血清型［1］。覆蓋了我國(guó)71．9%的分離肺炎球菌菌株的血清型［4］。其廣泛推薦在有某些對(duì)肺炎球菌易感因素的成年人和大于2歲的兒童中使用，這些因素包括有慢性心、肺、肝臟等疾病。

不同人群在自然狀態(tài)下對(duì)肺炎球菌應(yīng)答情況及應(yīng)答過(guò)程中產(chǎn)生抗體量的情況目前暫不完全清楚。本研究通過(guò)間接酶聯(lián)免疫試驗(yàn)檢測(cè)人體血清中的抗肺炎球菌莢膜多糖IgG，IgM，了解健康人群、CAP患者在自然狀態(tài)下免疫應(yīng)答的水平。

1 資料與方法

1．1 研究對(duì)象 實(shí)驗(yàn)中CAP患者，健康對(duì)照組血液標(biāo)本為2010年8月至2012年3月我院呼吸內(nèi)科就診患者，采血均知情同意，健康人組為同期我院體檢科體檢自愿者。健康人組男13名，女17名，平均年齡為（39．77±5．89）歲。納入研究的CAP組包括男19名，女13名，平均年齡為（46．28±22．2）歲。CAP診斷：（1）符合CAP的診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)2006年制定的CAP診斷和治療指南［5］；（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：孕婦；明確或高度懷疑肺結(jié)核患者；支氣管擴(kuò)張、間質(zhì)性肺疾病等原發(fā)肺基礎(chǔ)疾病。

1．2 標(biāo)本采集和實(shí)驗(yàn)室參考血清制備 用促凝管抽取血液約4ml，在離心機(jī)中以3 000轉(zhuǎn)／分，離心5分鐘，取血清封裝于高壓滅菌的離心管中，保存于－70℃冰箱中備用。將50名等量健康人血清混勻制成實(shí)驗(yàn)室參考血清。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中探測(cè)疫苗最佳包被濃度、最佳血清稀釋度等分裝于滅菌安瓿中－70℃保存。

1．3 主要儀器及試劑 酶標(biāo)儀（BIO－TEK INSTRUMENTS．INC公司）；96孔ELASISA聚苯乙烯板（廣州威佳生物公司）；23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗（紐莫法，美國(guó)默沙東公司）；小牛血清白蛋白（BSA，杭州四季清公司）；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記羊抗人IgG（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記羊抗人IgM（武漢博士德生物工程有限公司）；H2O2／TMB底物（北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)有限公司）；包被緩沖液（PBS）；洗滌液：0．05%Tween20磷酸鹽緩沖液（PBST）；抗體緩沖液：含1%BSA 的0．05%Tween磷酸鹽緩沖液（PBST）。

1．4 研究方法 本實(shí)驗(yàn)主要根據(jù)WHO發(fā)布的關(guān)于《ELISA法定量測(cè)定抗肺炎球菌莢膜多糖血清特異性IgG 抗體培訓(xùn)手冊(cè)》（Training mannual for Enzyme Linked Immunosorbent Assay for the quantitation of Streptococcus pneumoniae serotype specific IgG Pn PS ELISA）［6］及根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室條件采用間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)。通過(guò)棋盤滴定得出檢測(cè)不同類型抗體最佳抗原包被濃度、血清稀釋倍數(shù)及酶標(biāo)二抗?jié)舛取?/p>

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。各組計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示。組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0．05被認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)上有顯著性差異。

1．6 結(jié)果記錄

結(jié)果中記錄OD值為復(fù)孔算術(shù)平均值與最高空白對(duì)照值的差，最高空白對(duì)照值控制在0．01以下。每塊酶標(biāo)板以實(shí)驗(yàn)室參考血清稀釋倍數(shù)及相應(yīng)OD值做擬合曲線，R2為0．990±0．003，以擬合方程計(jì)算結(jié)果，以樣本血清抗體濃度相對(duì)參考血清的抗體濃度的比值來(lái)表示結(jié)果。

2 結(jié)果

CAP患者抗肺炎球菌莢膜多糖特異性免疫球蛋白IgM高于健康人，但P值為0．109，兩者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異。CAP患者抗肺炎球菌莢膜多糖特異性免疫球蛋白IgG高于健康人，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異（P＜0．01），見表1。

表1 各組血清抗肺炎球菌莢膜多糖IgM、IgG值

3 討論

肺炎球菌莢膜多糖抗原為TI抗原，進(jìn)入機(jī)體后在48小時(shí)內(nèi)，即與B1細(xì)胞表面的BCR結(jié)合，通過(guò)受體交聯(lián)使后者活化，分化成抗體分泌細(xì)胞，并迅速分泌IgM抗體，直接或通過(guò)補(bǔ)體經(jīng)調(diào)理作用清除病原體。IgM是初次體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體，血清檢出IgM提示新近發(fā)生感染。

肺炎球菌莢膜多糖為TI－2抗原，其免疫應(yīng)答機(jī)制尚未完全闡明。普遍認(rèn)為，TI－2抗原存在大量重復(fù)抗原表位，能激活補(bǔ)體旁路途徑和凝集素途徑，刺激成熟B1細(xì)胞和邊緣區(qū)B細(xì)胞。TI－2抗原表位與BCR相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合，提供第一信號(hào)，同時(shí)通過(guò)其重復(fù)性抗原表位使BCR發(fā)生交聯(lián)，提供第二信號(hào)，從而激活B細(xì)胞，應(yīng)答過(guò)程不需T細(xì)胞的輔助。一般認(rèn)為，針對(duì)TI－2抗原的應(yīng)答只產(chǎn)生IgM抗體，不發(fā)生Ig類別轉(zhuǎn)換，也不產(chǎn)生記憶性B細(xì)胞。但也有證據(jù)顯示，T細(xì)胞的輔助可以增強(qiáng)B細(xì)胞對(duì)TI－2抗原的應(yīng)答，并誘導(dǎo)抗體類別轉(zhuǎn)換，這一過(guò)程與Th細(xì)胞激活釋放的某些細(xì)胞因子有關(guān)，這些細(xì)胞因子作用于B細(xì)胞后不僅增強(qiáng)抗體應(yīng)答，且促進(jìn)抗體類別轉(zhuǎn)換［7］。

本研究提示，CAP患者在感染初期抗肺炎球菌IgM抗體水平明顯升高，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道社區(qū)獲得性肺炎常見病原菌為肺炎球菌相符［8］。健康人血清存在一定量的抗肺炎球菌莢膜多糖IgM抗體，其值總體偏低，可能與肺炎球菌定植有關(guān)。在一般情況下，機(jī)體對(duì)肺炎球菌存在一定的抵抗力，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降、免疫抑制及病原菌異位時(shí)就會(huì)引起機(jī)體感染。

本研究結(jié)果表明，健康人血清中存在抗肺炎球菌莢膜多糖IgG抗體，且在健康人群中其濃度符合正態(tài)分布，提示人體感染肺炎球菌是一種普遍現(xiàn)象，或人體在自然狀態(tài)下能對(duì)寄生狀態(tài)下的肺炎球菌產(chǎn)生免疫應(yīng)答，且可形成免疫記憶。這與相關(guān)文獻(xiàn)中提到TI抗原能產(chǎn)生免疫記憶相一致［7］。

CAP患者抗肺炎球菌莢膜多糖IgG抗體水平高于健康人，符合再次免疫機(jī)體體液免疫應(yīng)答的一般規(guī)律，即產(chǎn)生的抗體以IgG為主，且抗體應(yīng)答迅速，峰值高。由于肺炎球菌長(zhǎng)期定植于人體鼻咽部，CAP患者既往多次感染多種血清型肺炎球菌并可能已對(duì)本次致病的肺炎球菌產(chǎn)生免疫應(yīng)答，形成免疫記憶，當(dāng)機(jī)體再次感染同種血清型肺炎球菌莢膜多糖時(shí)即產(chǎn)生高滴度的IgG抗體。其特異性IgG抗體濃度高于健康人。根據(jù)機(jī)體體液免疫應(yīng)答的一般規(guī)律，二次應(yīng)答的能力可持續(xù)存在數(shù)個(gè)月或數(shù)年，故機(jī)體一旦感染后可持續(xù)相當(dāng)時(shí)間不再感染相同病原體［9］。表明機(jī)體在自然狀態(tài)下存在對(duì)肺炎球菌有較強(qiáng)的免疫應(yīng)答能力，且TI抗原可以引起機(jī)體免疫記憶。據(jù)此可得出結(jié)論，CAP患者能在自然感染過(guò)程中產(chǎn)生一定量抗肺炎球菌莢膜多糖抗體，且此類抗體能持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間具有保護(hù)作用，是否需要予以健康人常規(guī)進(jìn)行肺炎球菌莢膜多糖疫苗接種需進(jìn)一步研究。

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