慢性腎功能衰竭腎陽虛型大鼠腎組織細胞糖皮質激素受體、細胞白介素-1β及腫瘤壞死因子-α的變化*

吳 凡 張紅梅 陳雪功 王億平 董昌武 周雪梅

（安徽中醫(yī)學院中醫(yī)臨床學院，安徽 合肥 230038）

慢性腎功能衰竭（CRF）是指各種慢性腎病引起的腎小球濾過率下降（GFR＜90 mL/min）和腎臟其他功能損害，及由此產生的代謝紊亂和臨床癥狀組成的綜合征［1］。多數(shù)CRF患者以腎陽虧虛為本，濕濁內蘊為標。而 CRF 與白介素-1（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等微炎癥因子、及糖皮質激素受體（GR）等同腎陽虛型CRF病證結合的研究還未涉及，本實驗對腎陽虛型CRF的證候學基礎進行進一步的研究。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器 濟生腎氣丸劑量配比參照《中醫(yī)方劑大辭典》：熟地黃15 g，山茱萸30 g，牡丹皮30 g，山藥30 g，茯苓30 g，澤瀉30 g，肉桂 15 g，附子（制）15 g，牛膝15 g，車前子30 g，由安徽中醫(yī)學院中醫(yī)門診部提供。保腎康片（亨達制藥，國藥準字Z20003105）；IL-1β試劑盒、TNF-α試劑盒由上海森雄實業(yè)科技有限公司提供；GR試劑盒由上海源葉生物科技有限公司提供；腺嘌呤由中科院上海生化研究所提供（分子量135.13）、尿蛋白定量試劑盒、尿素氮測定試劑盒、肌酐測定試劑盒由南京建成生物工程研究所生產。尿蛋白定性測試紙由蘇州第一制藥廠生產 （批號：20110814）。日立7020全自動生化分析儀、Multiskan MK2酶標儀（Labsystem）、Wellwash 4 MK2 洗板機（Labsystem）、UV8100型751紫外可見分光光度計 （北京萊伯泰科儀器有限公司）、800型TGL-168離心沉淀器（江蘇金壇市金城國盛實驗儀器廠生產）、Olympus BX51型光學顯微鏡（奧林巴斯公司生產）。

1.2 動物 SD雄性大鼠，體質量（200±20）g，由安徽省動物實驗中心提供，批號：SCXK（皖）2011-002。

1.3 分組及造模 40只雄性SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周，測尿蛋白（-）。隨機分為正常組、模型組、保腎康組、濟生腎氣丸組，每組10只。參照文獻制作CRF腎陽虛動物模型［2］，除正常組外其他3組均以每日200 mg/kg劑量的腺嘌呤灌胃。實驗24 d，第1～12日每日灌胃1次，第12日后隔日灌胃1次。

1.4 給藥方法 濟生腎氣丸組和保腎康組均同時分別以每日40 g/kg和33.3 mg/kg的劑量進行預防性治療，兩種藥物劑量為中等臨床劑量。造模及給藥過程中，由于灌胃等因素，模型組死亡1只，濟生腎氣丸組死亡1只，然后從各組剩余大鼠中隨機選取8只用于標本制作和檢測。

1.5 標本采集與檢測 實驗結束前1 d代謝籠收集大鼠24 h尿液。實驗結束后，10％水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血，冷凍離心（4 ℃，2000 g，10 min）收集血清，-20℃冰箱中保存待測；全自動生化儀檢測血肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白。左側腎臟制作病理切片，光鏡（×200）下觀察腎小球、腎小球囊腔、系膜及系膜基質的病理改變；摘取右側腎臟組織100 mg，加入PBS緩沖液，按照 1∶9 比例進行勻漿，離心（4 ℃，2000 g，10 min）收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附（Elisa）法測定腎臟組織IL-1β，INF-α及GR水平。常規(guī)進行梯度稀釋標準品、加樣、配液、洗板、顯色等步驟，在450 nm波長測定各孔吸光度，根據(jù)標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。操作步驟嚴格按照試劑盒說明進行。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠24 h尿蛋白定量、血清BUN及SCr水平比較 見表1。結果示，模型組大鼠24 h尿蛋白、血清BUN及SCr都顯著高于正常對照組（P＜0.05），濟生腎氣丸及保腎康都能降低24 h尿蛋白、血清BUN及SCr，與模型組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠腎組織細胞IL-1β、TNF-α及GR水平比較 見表2。模型組大鼠腎組織細胞的IL-1β、INF-α與正常組比較明顯升高（P＜0.05），GR明顯降低（P＜0.05）；而濟生腎氣丸組、保腎康組都能降低IL-1β、INF-α，升高 GR，與模型組比較差異明顯（P＜0.05）。且濟生腎氣丸在降低IL-1β、INF-α，升高GR方面更為顯著（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠腎組織病理的變化 見圖1。正常組的腎小球大小均勻，正常形態(tài)，系膜細胞及基質無增生，毛細血管結構清晰。模型組腎小球充血，腎小體數(shù)量減少，腺嘌呤代謝結晶占據(jù)大部分腎小管和腎小球。腎小管代償性擴張，大部分腎小管內可見紅染的膠凍樣管型，部分腎小管被增生的纖維組織所代替，其間可見較多的淋巴細胞浸潤；少數(shù)腎小球有輕度萎縮，個別腎小球有代償性肥大。濟生腎氣丸組：腎小球輕度充血，有少量腺嘌呤代謝結晶沉積，間質有少量炎細胞浸潤，血管擴張、有輕度充血。部分腎小管內可見少量粉染分泌物，少數(shù)腎小管上皮細胞有脫落。保腎康組：腎小球內中度充血，可見較多腺嘌呤代謝結晶沉積于腎小管和腎小球，部分異形細胞形成。未被累及的腎小管管腔有擴張，管腔內有膠凍樣管型沉積，間質內有局灶性纖維組織增生。

表1 各組大鼠24 h尿蛋白定量、血清BUN及SCr水平比較（±s）

表1 各組大鼠24 h尿蛋白定量、血清BUN及SCr水平比較（±s）

與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組 別 n SCr（μmol/L）保腎康組 8 154.08±29.86*△正常組 8 63.58±9.82模型組 8 184.34±38.62*濟生腎氣丸組 8 143.62±27.60*△尿蛋白（mg/24 h）BUN（mmol/L）100.38±13.1*△ 21.08±4.53*△60.57±18.63 7.41±0.8 134.31±15.6* 33.58±7.6*82.21±7.4*△ 20.16±3.32*△

表2 各組大鼠腎組織細胞IL-1β、TNF-α及GR水平比較（pg/mL±s）

表2 各組大鼠腎組織細胞IL-1β、TNF-α及GR水平比較（pg/mL±s）

與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與保腎康組比較，☆P＜0.05。

組 別 n GR保腎康組 8 0.64±0.15*△正常組 8 1.07±0.14模型組 8 0.50±0.09*濟生腎氣丸組 8 0.787±0.09*△☆IL-1β TNF-α 0.74±0.03*△ 0.82±0.05*△0.35±0.03 0.512±0.03 0.90±0.042* 1.14±0.04*0.55±0.04*△☆ 0.63±0.04*△☆

圖1 各組大鼠腎臟組織病理形態(tài)變化（HE染色，×200）

3 討論

CRF是一種常見的臨床綜合征。該病的發(fā)病率高，并且難以治愈，也是困擾當今醫(yī)學界的一個難題。中醫(yī)學認為CRF的病機為腎陽虧虛為本，濕濁內蘊為標，治療上是以溫補腎陽兼以化濕泄?jié)釣榉ā?/p>

IL-1β是一種具備多種生物功能的強有力的炎癥細胞因子，對體內幾乎所有類型的細胞均有作用，可調節(jié)許多局部和系統(tǒng)的炎癥反應，它通過誘導轉錄因子激活物蛋白和核因子xB（NF-xB）發(fā)揮生物活性，也可促進T細胞的增殖分化及活化，刺激T細胞分泌IL-2、IL-4等細胞因子，促進IL-2受體的表達，參與腎臟的炎性改變。腎小球系膜細胞和內皮細胞等多種細胞亦可分泌IL-1β，IL-1β可通過上調腎小管上皮細胞兩種骨架蛋白的蛋白合成和基因表達，誘導腎小管上皮細胞向腎間充質細胞表型發(fā)生轉化［3］，從而在腎小管間質纖維化發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。IL-1β可通過影響腎小管上皮細胞發(fā)生表型轉化（EMT），從而影響腎間質巨噬細胞積聚，以及參與腎纖維化發(fā)生與發(fā)展［4］。TNF-α是機體炎癥和免疫應答的重要調節(jié)因子，與炎癥的關系極為密切，主要由激活的單核/巨噬細胞、T淋巴細胞所產生，腎臟固有細胞，如系膜細胞、內皮細胞、腎小管上皮細胞均能產生。增高的TNF-α既加重炎癥反應及系膜細胞的增殖，促進腎單位受損和腎小球硬化；TNF-α刺激腎小球系膜細胞產生氧自由基，使過氧化脂質代謝產物增多，造成細胞內膜損傷，調動與膠原代謝有關的細胞因子，促進腎小球細胞釋放膠原酶，引起蛋白降解，從而加重腎功能損害。TNF-α可以促使白細胞合成，釋、放超氧化物和蛋白水解物，引起組織損傷［5］。

本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組IL-1β和TNF-α水平明顯升高，提示炎癥細胞因子IL-1β及TNF-α在CRF中發(fā)揮重要作用，可能對腎小管上皮細胞轉化從而促進腎間質纖維化等產生一定的作用，并通過細胞因子的相互作用，共同影響CRF的發(fā)生和轉歸。GR是位于細胞上或細胞內的一類特異蛋白質，與糖皮質激素結合后活化，進入細胞核結合糖皮質激素應答元件，促進磷酸烯醇丙酮酸羧激酶等基因的表達。GR在下丘腦-垂體-靶腺軸（HPA軸）中占有重要地位，HPA軸與腎陽密切相關，GR表達水平的變化是腎陽虛發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié)之一。本實驗發(fā)現(xiàn)：模型組大鼠的24 h尿pro、BUN、Scr都明顯升高，而GR顯著降低，并且出現(xiàn)多尿、多飲、精神萎靡，逐漸出現(xiàn)食少、體質量減輕、毛色千枯，耳輪蒼白，尾巴濕冷、活動減少、豎毛、蜷縮，外陰周圍濕毛等陽虛表現(xiàn)；而濟生腎氣丸能降低IL-1β、INF-α水平，改善陽虛表現(xiàn)，并升高GR水平。一方面說明腺嘌呤灌胃復制的CRF模型具有腎陽虛病證結合的特點；另一方面也說明濟生腎氣丸在降低BUN、Scr、改善蛋白尿上和升高GR方面有一定的療效，從方證相應和療效反證的角度進一步證明IL-1β、INF-α水平增高、GR水平下降等可能與CRF腎陽虧虛、濕濁內蘊的病理本質密切相關，而調節(jié)炎癥因子，提高糖皮質受體水平可能成為中醫(yī)藥防治CRF的重要的方法和途徑。

［1］葉任高，李幼姬，劉冠賢.臨床腎臟病學［M］.2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：530.

［2］傅曉晴，林若勤，武一曼，等.腺嘌呤制作腎陽虛型慢性腎功能衰竭大鼠模型的生化研究［J］.福建中醫(yī)學院學報，2003， 13（1）：22-24.

［3］楊汝春，魯盈，朱曉玲，等.白介素-1β 誘導腎小管上皮細胞向間充質細胞轉化的實驗研究［J］.醫(yī)學研究雜志，2007，36（11）：33-36.

［4］王光蘭，陳 爽，王心蕊，等.白細胞介素1β誘導腎小管上皮細胞轉分化及其對細胞骨架的影響［J］.中國免疫雜志，2010，26（3）：210-213.

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