復(fù)方清熱顆粒對鮑氏不動桿菌外排泵影響的實驗研究*

楊鳳春 任愛民 王 紅 張淑文

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050）

鮑氏不動桿菌屬于條件致病菌，是目前醫(yī)院感染的重要病原菌之一，成為僅次于銅綠假單胞菌的第2位非發(fā)酵菌［1-2］。多項研究［2-4］表明復(fù)方清熱顆粒具有抗菌活性，可以改善細(xì)菌的耐藥性。本實驗從中藥復(fù)方清熱顆粒入手，觀察其對鮑氏不動桿菌的耐藥性的影響，以探討復(fù)方清熱顆粒能否改善外排泵陽性鮑氏不動桿菌的耐藥情況。

1 材料

1.1 動物及菌株 健康大耳白兔，體質(zhì)量1.8~2.5 kg，購自首都醫(yī)科大學(xué)動物實驗房，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，監(jiān)測并記錄心率、呼吸頻率、肛溫、體質(zhì)量及攝食情況。實驗菌株為2012年3月至2012年9月北京友誼醫(yī)院住院患者分離的鮑氏不動桿菌，所有菌株均經(jīng)法國生物梅里埃VITEK全自動微生物系統(tǒng)鑒定。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853，北京友誼醫(yī)院檢驗中心保存菌株。

1.2 藥物和試劑 環(huán)丙沙星（CIP）購自上海董李貿(mào)易有限公司，批號：85721-33-1，純度≥98％；西黃耆膠，購自上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；復(fù)方清熱顆粒，由蒲公英、敗醬草、虎杖、半枝蓮、大黃、黃芪組成，購自北京康仁堂藥業(yè)有限公司；碳酰氰基-對-氯苯腙（CCCP）購自美國Sigma公司；DMSO購自美國Sigma公司；血瓊脂培養(yǎng)皿購自天津金章科技發(fā)展有限公司；M-H瓊脂粉購自BD公司。

1.3 實驗設(shè)備 電熱恒溫培養(yǎng)箱 DH6000AB型，天津市泰斯特儀器有限公司。光電比濁儀，法國，生物－梅里埃公司。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。所有數(shù)據(jù)以（±s）表示。數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布者，計量資料采用t檢驗，兩組間的比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 方法與結(jié)果

2.1 含藥血清的制備 將14只大耳白兔隨機(jī)分為兩組，模型組8只，對照組6只。禁食12h，模型組給予腹腔注射多重耐藥鮑氏不動桿菌菌液，注射劑量2.5×109/kg，12 h后測肛溫、血常規(guī)，體溫＞39.5℃、白細(xì)胞總數(shù)＞13×109/L者入選，模型組有6只白兔符合上述標(biāo)準(zhǔn)而入選。造模成功后分別記錄模型組及對照組大耳白兔的心率（HR）、呼吸頻率（R）、肛溫（T）、體質(zhì)量（W）及攝食情況。模型組于造模成功后第2日開始給予復(fù)方清熱顆粒劑藥液灌胃，每日 2 次，劑量為 22 g/（kg·d），連續(xù)給藥5 d。對照組給予同等體積的蒸餾水灌胃，同樣是每日2次，連續(xù)5 d。治療期間監(jiān)測并記錄兩組大耳白兔的心率、呼吸頻率、肛溫、體重及攝食情況，同時各組大耳白兔每日均正常飼料喂養(yǎng)，治療結(jié)束后禁食12 h，無菌心臟采血，4000 r/min離心10 min，分離出含藥血清和空白血清后同組混和，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。各組治療前后R，HR，T，W的變化見表1。

2.2 CCCP工作濃度的確定 準(zhǔn)確稱取CCCP粉劑，先用少量DMSO溶解，然后再加無菌蒸餾水至所需體積。分別配制 2000、1000、500、200、100、50 μg/mL 的CCCP溶液，過濾除菌備用。于每個平板（直徑90 mm）中對應(yīng)加入上述CCCP溶液2 mL和已消毒并冷卻至50℃左右的MH培養(yǎng)基18 mL，充分混勻，配成分別含有終濃度為 200、100、50、20、10、5 μg/mL 的含 CCCP瓊脂平板，將32株臨床分離的耐環(huán)丙沙星鮑氏不動桿菌分別劃線接種于上述配制好的瓊脂平板，同時接種不含CCCP的瓊脂平板做對照，接種量為1×105CFU/mL，接種完畢后置36℃恒溫箱中培養(yǎng)20 h，觀察結(jié)果。在CCCP終濃度為200 μg/mL時，無菌株生長；在CCCP終濃度為100 μg/mL時，有16株鮑氏不動桿菌不生長，其他菌株均生長良好；在CCCP終濃度為50 μg/mL時，有6株鮑氏不動桿菌不生長，其他菌株均生長良好；在 CCCP 終濃度分別為 20、10、5 μg/mL 時，所有菌株均生長良好，且形態(tài)染色及菌落特征典型。故20、10、5 μg/mLCCCP均可作為實驗用外排泵抑制劑CCCP的工作濃度。本實驗中采用濃度10 μg/mL的CCCP。

2.3 篩選外排泵陽性鮑氏不動桿菌 選出臨床分離的耐環(huán)丙沙星鮑氏不動桿菌32株，分別挑取單個菌落平板劃線于血瓊脂培養(yǎng)皿中，36℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，然后分別挑取單菌落，用生理鹽水稀釋，比濁儀調(diào)節(jié)菌液至0.5麥?zhǔn)蠞舛燃s108CFU/mL，同法配制銅綠假單胞菌ATCC27853菌懸液作質(zhì)控。制備含環(huán)丙沙星的MH瓊脂平皿，CIP的質(zhì)量濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL， 將 32 株鮑氏不動桿菌分別接種于已配制好的含不同濃度環(huán)丙沙星的MH瓊脂平皿中，細(xì)菌接種量約為105CFU。即采用瓊脂對倍稀釋法測出CIP對上述32株鮑氏不動桿菌的最小抑菌濃度（MIC）值（藥物敏感試驗的操作及結(jié)果的解釋參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會（CLSI）2011版標(biāo)準(zhǔn)［5］）。稱取 4 mg CCCP，用 2 mL 二甲基亞砜將其充分溶解，再用8 mL蒸餾水將濃度稀釋至400 μg/mL。將配制的CCCP溶液加入到含不同濃度環(huán)丙沙星的瓊脂平皿中，每個平皿中均加入0.5 mL，使每個平皿中CCCP的濃度均為 10 μg/mL，CIP質(zhì)量濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL。并設(shè)一空白對照組和CCCP濃度為10 μg/mL的對照組。將32株鮑氏不動桿菌菌懸液及質(zhì)控菌株菌懸液接種于上述培養(yǎng)基中，接種細(xì)菌量均為105CFU，36℃溫箱中培養(yǎng)20 h，測出環(huán)丙沙星聯(lián)合CCCP時對上述32株鮑氏不動桿菌的MIC值。比較上述兩組MIC值，如在有CCCP的情況下MIC值下降至原來的1/4或以下，即認(rèn)為該菌株為外排泵陽性菌株［6］（根據(jù)MIC值大小分別命名為Pa1～Pa8，見表2），空白MH瓊脂平板和CCCP濃度為10 μg/mL瓊脂平板上細(xì)菌均生長良好。

2.4 外排泵陽性鮑氏不動桿菌株的藥敏結(jié)果 （1）測定含藥血清及空白血清MIC值：配制20 mL含藥血清及空白血清MH瓊脂平皿，含藥血清含量分別為0.5、1、2、4 mL，空白血清含量分別為 0.5、1、2、4 mL。接種上述8株鮑氏不動桿菌菌懸液及質(zhì)控菌株菌懸液于含藥血清及空白血清瓊脂平皿中，細(xì)菌接種量約為105CFU，于36℃恒溫箱培育20 h。上述4個含藥血清及空白血清MH瓊脂平皿上8株鮑氏不動桿菌菌均生長良好。未測出含藥血清及空白血清的MIC值。（2）測定復(fù)方清熱顆粒的MIC值：稱取1g復(fù)方清熱顆粒，加入25 mL蒸餾水中，使之充分溶解，過濾除菌備用。配制含中藥復(fù)方清熱顆粒的MH瓊脂平皿，中藥濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10、20 mg/mL。分別接種上述 8 株菌懸液及質(zhì)控菌株菌懸液約105CFU于其中，并于36℃恒溫箱培育20 h，各MIC值見表3。（3）測定復(fù)方清熱顆粒+CIP組MIC值：制備含復(fù)方清熱顆粒和CIP的MH瓊脂平皿，分為4組，每組CIP的質(zhì)量濃度均包括0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL。4 組的中藥濃度分別為 0.625、1.25、2.5、5 mg/mL。分別接種 8株菌懸液及質(zhì)控菌株懸液于各MH瓊脂平皿中，細(xì)菌接種量約為105CFU，并于36℃恒溫箱培育20 h，各組MIC值見表4。CIP組與CIP+中藥2.5 mg/mL組比較，差異明顯（P＜0.05）；CIP組與CIP+中藥5 mg/mL組比較，差異明顯（P＜0.01）。（4）測定空白血清+CIP 組、含藥血清+CIP組MIC值：配制含空白血清和CIP的MH瓊脂平皿，每個平皿中均加入空白血清2 mL，CIP濃度分別為1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL （命名為1組）。接種上述菌懸液于MH瓊脂平皿，細(xì)菌接種量約為105CFU，并于36℃恒溫箱培育20 h。配制含藥血清和CIP的MH瓊脂平皿，分為3組，每組CIP的質(zhì)量濃度均包括 1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL。3 組瓊脂平皿中含藥血清分別為0.5、1、2 mL（命名為2、3、4組）。分別接種上述菌懸液及質(zhì)控菌株菌懸液于MH瓊脂平皿，菌量約為105CFU，并于36℃恒溫箱培育20 h，CIP組、空白血清+CIP組、含藥血清+CIP組MIC值比較見表5。CIP組與CIP+含藥血清2 mL組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（5）測定空白血清＋CCCP＋CIP組、含藥血清＋CCCP＋CIP組、復(fù)方清熱顆粒＋CCCP＋CIP組MIC值：制備MH瓊脂平皿，每個瓊脂平皿中均含空白血清 2 mL，CCCP的濃度均為 10 μg/mL，CIP的濃度分別為 1、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL。分別接種上述菌懸液及質(zhì)控菌株菌懸液于MH瓊脂平皿，菌量約為105CFU，36℃恒溫箱培育20 h。同樣方法測定含藥血清＋CCCP＋CIP組MIC值，每個MH瓊脂平皿中均包含含藥血清2 mL，CCCP濃度、CIP濃度均同上。同樣方法測定復(fù)方清熱顆粒＋CCCP＋CIP組MIC值，每個MH瓊脂平皿中復(fù)方清熱顆粒濃度均為2.5 mg/mL，CCCP濃度、CIP濃度同上，以上分別命名為1、2、3組，各組MIC值比較見表6。CIP+CCCP組與復(fù)方清熱顆粒+CIP+CCCP組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 兩組治療前后R，HR，T，W的變化（，±s）

表1 兩組治療前后R，HR，T，W的變化（，±s）

與治療前比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組 別（n＝6） 治療后模型組 治療前（n＝8） 治療后對照組 治療前R（次/min） HR（次/min） T（℃） W（kg）80.53±11.92 233.33±19.52 39.03±0.34 2.20±0.086 105.50±4.64 251.67±11.69 40.23±0.27 2.38±0.16 98.97±5.49* 235.23±17.84*39.58±0.29**2.33±0.15 78.48±15.73 233.01±23.90 39.00±0.43 2.19±0.12

表2 應(yīng)用CCCP前后CIP對外排泵陽性鮑氏不動桿菌MIC（μg/mL）值變化

3 討論

隨著對主動外排系統(tǒng)的深入研究，研究發(fā)現(xiàn)，越來越多的臨床常見病原菌存在與耐藥有關(guān)的主動外排系統(tǒng)，細(xì)菌主動外排作用已被認(rèn)為是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的重要機(jī)制。有研究表明［5］主動外排泵是介導(dǎo)鮑氏不動桿菌多重耐藥及泛耐藥的主要機(jī)制之一，與鮑氏不動桿菌多重耐藥有關(guān)的主動外排系統(tǒng)主要包括Ade-ABC、AdeIJK、AdeFGH，屬于 RND 家族。

為了減少細(xì)菌的多重耐藥性，筆者從細(xì)菌主動外排泵耐藥機(jī)制入手，尋求抑制主動外排泵的方法。CCCP是一種抑制質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)的解耦聯(lián)劑，可以抑制主動外排系統(tǒng)能量來源的質(zhì)子濃度梯度，破壞外排系統(tǒng)的主動外排作用，使抗菌藥物在細(xì)菌體內(nèi)的累積量增加，恢復(fù)細(xì)菌對抗生素的敏感性，但由于毒副作用過大，限制了其在臨床中的使用。這就需要研發(fā)新的毒副作用小的藥物或?qū)で笃渌緩絹砀纳萍?xì)菌耐藥性［6］。

表3 復(fù)方清熱顆粒對鮑氏不動桿菌MIC值的影響（mg/mL）

表4 應(yīng)用復(fù)方清熱顆粒（mg/mL）前后CIP對8株外排泵陽性鮑氏不動桿菌MIC值（μg/mL）

表5 應(yīng)用空白血清、含藥血清前后CIP對鮑氏不動桿菌MIC 值（μg/mL）

表6 空白血清+CCCP+CIP、含藥血清+CCCP+CIP組、復(fù)方清熱顆粒+CCCP+CIP組MIC值（μg/mL）

本研究以中藥復(fù)方清熱顆粒含藥血清為主要研究對象，以空白血清作為對照，并且和復(fù)方清熱顆粒劑原液組進(jìn)行比較，觀察環(huán)丙沙星及環(huán)丙沙星分別聯(lián)合含藥血清、空白血清及復(fù)方清熱顆粒劑原液后對外排泵陽性鮑氏不動桿菌MIC值的變化。其后，在泵抑制劑CCCP抑制了外排泵后，觀察環(huán)丙沙星及環(huán)丙沙星分別聯(lián)合含藥血清、空白血清及復(fù)方清熱顆粒劑原液后對外排泵陽性鮑氏不動桿菌MIC值的變化。實驗表明：（1）環(huán)丙沙星＋含藥血清組的MIC值與環(huán)丙沙星組比較，MIC值明顯下降，說明含藥血清能明顯改善外排泵陽性鮑氏不動桿菌對環(huán)丙沙星的耐藥情況。（2）環(huán)丙沙星＋含藥血清＋CCCP組的MIC值與環(huán)丙沙星＋CCCP組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而上面實驗結(jié)果顯示含藥血清能明顯改善鮑氏不動桿菌對環(huán)丙沙星的耐藥情況，說明CCCP阻斷外排泵后含藥血清改善鮑氏不動桿菌對環(huán)丙沙星耐藥的作用減弱，從而提示含藥血清可能是通過抑制鮑氏不動桿菌的外排泵來改善鮑氏不動桿菌對環(huán)丙沙星的耐藥性。（3）環(huán)丙沙星＋中藥原液組較環(huán)丙沙星組MIC值下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明中藥能改善鮑氏不動桿菌對環(huán)丙沙星的耐藥情況。此外，環(huán)丙沙星＋CCCP＋中藥組MIC值較環(huán)丙沙星＋CCCP組MIC值明顯下降，表明中藥原液可能是通過多種途徑改善鮑氏不動桿菌對環(huán)丙沙星的耐藥情況。

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［5］Clinical and laboratory standards institute（CLSI）/NCCLS performance standards for antimicrobial susceptibility testing：twenty-First informational supplement M100-S21（ISBN 1-56238-742-1）M07-A8-Methods for dilution antimicrobia susceptibility tests for bacteria［J］.M100-S21，2011，31（1）：1-163.

［6］馬真，蔡紹曦，佟萬成.耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌外排泵AdeABC 的研究［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，31（8）：1378-1381.