黃芪失笑散對(duì)急性心肌梗死大鼠心功能及Caspase-8表達(dá)的影響*

魏麗萍 陳鐵龍 赫小龍 祝光禮

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)V興醫(yī)院，浙江 杭州 310007）

隨著社會(huì)發(fā)展及生活方式的轉(zhuǎn)變，心血管疾病日益增多，尤其急性心肌梗死，其發(fā)病急，致死率高，已成為嚴(yán)重影響我國(guó)人民健康的疾病。黃芪失笑散臨床應(yīng)用可以有效緩解冠心病心絞痛癥狀，前期研究發(fā)現(xiàn)其具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)血管內(nèi)皮功能及促血管新生的作用［1-3］。本研究通過(guò)觀(guān)察該方對(duì)急性心肌梗死大鼠心功能及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響，進(jìn)一步探討其對(duì)缺血心肌保護(hù)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性SD大鼠120只，浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（浙）2008-0033，體質(zhì)量180～220 g。

1.2 藥物與試劑 黃芪失笑散（組成：黃芪30 g，蒲黃20 g，五靈脂20 g，濃縮成2 g/mL的生藥煎劑，本院制劑室提供）；Caspase-8兔多克隆抗體、一抗稀釋液、HRP標(biāo)記二抗（杭州達(dá)文生物有限公司）；蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法，北京普利萊基因技術(shù)有限公司）。

1.3 大鼠急性心梗模型的建立 將120只SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組24只。模型組（灌胃滅菌蒸餾水2 mL/d），黃芪失笑散大、中、小劑量組（每日灌胃黃芪失笑散 28、14、7g/kg）、對(duì)照組（灌胃滅菌蒸餾水 2mL/d），連續(xù)灌胃7 d后進(jìn)行造模。大鼠麻醉后，予氣管插管及呼吸機(jī)輔助呼吸。于心尖搏動(dòng)處暴露心臟并打開(kāi)心包，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，心電圖出現(xiàn)ST段明顯弓背抬高提示急性心梗造模成功。后關(guān)閉胸腔，待動(dòng)物恢復(fù)自主呼吸后，拔除插管，停呼吸機(jī)。對(duì)照組除不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈外，其余手術(shù)過(guò)程一致。

表1 兩組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較（±s）

表1 兩組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與黃芪失笑湯小劑量組比較，#P＜0.01，##P＜0.05。下同。

組 別 n對(duì)照組 8模型組 8黃芪失笑湯小劑量組 8 LVSP（mmHg）LVEDP（mmHg）+dp/dtmax（mmHg/s）-dp/dtmax（mmHg/s）146.6±5.5** 6.0±1.9** 5894.1±672.2** 4839.6±239.8**76.3±24.3△△ 17.9±2.7△△ 3699.8±390.0△△ 2695.0±182.3△△100.7±5.8△△ 12.1±2.1**△△ 4003.3±515.7△△ 3122.9±164.6**△△黃芪失笑湯中劑量組 8 111.2±20.3*△ 8.4±1.3** 5052.3±536.5**△△ 4214.7±378.7**△△黃芪失笑湯大劑量組 8 123.5±23.1** 6.5±1.9** 5444.1±583.9**△△# 4498.7±499.5**△#

1.4 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 術(shù)后4.5 h行血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)。大鼠麻醉后，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，三通管連接20 G靜脈鞘管和壓力換能器，在頸總動(dòng)脈插入鞘管，通過(guò)Medlab-U/4 CS生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)觀(guān)察壓力曲線(xiàn)，測(cè)量并記錄每只大鼠的左室內(nèi)壓峰值（LVSP）、左室等容收縮末期壓力上升最大速度（+dp/dtmax），左室舒張末壓力（LVEDP）、左室壓力下降最大速度（-dp/dtmax）等參數(shù)。

1.5 Western Blot法測(cè)定心肌Caspase-8蛋白的表達(dá)取各組大鼠左室梗死邊緣區(qū)心肌組織，蛋白裂解液提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取各組樣品50 μg，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，用5％脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉1.5 h后，加入一抗4℃孵育過(guò)夜，后脫洗3次，然后加入二抗室溫下?lián)u床孵育1.5 h，后脫洗3次。ECL發(fā)光液顯色，膠片掃描后用Image J軟件進(jìn)行圖像分析，以β-actin（1∶1000稀釋?zhuān)┳鳛閮?nèi)參照對(duì)比，比值結(jié)果表示其蛋白的相對(duì)含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪失笑散對(duì)血流動(dòng)力學(xué)影響 見(jiàn)表1。與模型組相比，黃芪失笑散大、中劑量組可明顯改善LVSP、+dp/dtmax、LVEDP 和-dp/dtmax（P＜0.05 或 0.01）。與對(duì)照組比較，黃芪失笑散大劑量組在LVSP變化上無(wú)明顯差異（P＞0.05）；黃芪失笑散大劑量組在改善+dp/dtmax和-dp/dtmax方面與小劑量組有明顯差異 （P＜0.05），且存在 LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax隨黃芪失笑湯劑量的提高而升高的趨勢(shì)，LVEDP隨黃芪失笑湯劑量的提高而降低的趨勢(shì)，說(shuō)明黃芪失笑散對(duì)心梗后大鼠血流動(dòng)力學(xué)改善呈劑量依賴(lài)性，其中黃芪失笑散大劑量對(duì)血流動(dòng)力學(xué)各指標(biāo)改善程度最高。

2.2 黃芪失笑散對(duì)Caspase－8蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)表2。與對(duì)照組比，模型組Caspase-8蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。黃芪失笑散大、中劑量組與模型組相比，Caspase-8蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05或0.01）。黃芪失笑湯各劑量組間兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但是存在Caspase-8蛋白的表達(dá)水平隨黃芪失笑湯劑量的提高而降低的趨勢(shì)，說(shuō)明黃芪失笑散對(duì)Caspase-8蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用呈劑量依賴(lài)性，其中大劑量組的抑制作用較強(qiáng)（圖1）。

3 討論

急性心肌梗死是臨床常見(jiàn)急危重癥，心肌壞死的范圍與預(yù)后密切相關(guān)。目前研究表明細(xì)胞死亡有壞死和凋亡兩種機(jī)制，而凋亡先于壞死發(fā)生，是梗死灶擴(kuò)大的主要因子，并且存在于心肌梗死病理改變?nèi)^(guò)程［4］。因其具有可調(diào)控性，所以AMI的細(xì)胞凋亡領(lǐng)域成為了現(xiàn)代研究的熱點(diǎn)。Caspase家族 （Caspase-1～Caspase-14）參與細(xì)胞凋亡的全過(guò)程，是細(xì)胞凋亡的核心成分，其中Caspase-8是家族中細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)者之一，可以在外界促細(xì)胞凋亡因子的刺激下發(fā)生酶切而變?yōu)橛谢钚缘腸leaved Caspase-8（相對(duì)分子量18 kDa），從而啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終活化執(zhí)行者Caspase-3引起細(xì)胞凋亡。

中醫(yī)學(xué)并無(wú)急性心肌梗死的病名，多歸于 “真心痛”或“胸痹心痛”范疇，病機(jī)多與氣虛血瘀有關(guān)，故治療以益氣活血為主。黃芪失笑散以 《太平惠民和劑局方》中之失笑散為基礎(chǔ)，加用大劑量黃芪，全方共奏益氣活血、散結(jié)止痛之效。而現(xiàn)代研究表明黃芪及失笑散均有抑制細(xì)胞凋亡的作用［5-8］。本研究顯示黃芪失笑散可改善心肌梗死大鼠的心功能，下調(diào)活化的Caspase-8蛋白表達(dá)量，并呈劑量相關(guān)性，其中以大劑量組效果最好，從而進(jìn)一步證實(shí)了該方抗心肌缺血的確切作用，并揭示其機(jī)制與抑制Caspase-8的活化從而減少細(xì)胞凋亡有關(guān)，為臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供了較好的理論依據(jù)。

組 別 n對(duì)照組 6模型組 6黃芪失笑湯小劑量組 6 Caspase-8 0.26±0.07**0.54±0.13△△0.41±0.10黃芪失笑湯中劑量組 6 0.33±0.09*黃芪失笑湯大劑量組 6 0.28±0.02**

圖1 各組大鼠心肌組織Caspase-8蛋白的表達(dá)結(jié)果

［1］祝光禮，魏麗萍，方偉，等.黃芪失笑散對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)作用［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26（8）：1614-1616.

［2］祝光禮，魏麗萍，方偉，等.黃芪失笑散對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響［J］.浙江臨床醫(yī)學(xué)，2008，10（8）：1016-1018.

［3］祝光禮，范翠娟，陳鐵龍，等.黃芪失笑散對(duì)雞胚絨毛尿囊膜促血管生成實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2007，25（12）：2462-2464.

［4］謝志泉，劉伊麗.細(xì)胞凋亡與缺血性心臟?。跩］.臨床心血管病雜志，1999，15（10）：474.

［5］馬蘭，關(guān)振中.黃芪注射液對(duì)大鼠左室重構(gòu)及凋亡基因Caspase-3 的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，25（7）：646-649.

［6］趙淑敏，孔祥玉，周健，等.黃芪預(yù)處理對(duì)缺血再灌注大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用［J］.中國(guó)臨床康復(fù)，2005，9（27）：80-81.

［7］馮津萍，盧奕，趙炳讓?zhuān)?黃芪抑制家兔心肌缺血再灌注時(shí)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2001，8（1）：13-15.

［8］周小青，王大安，羅堯岳，等.活血化瘀類(lèi)方干預(yù)急性心肌缺血犬心肌組織病理改變及心肌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2003，1（12）：707-708.