不同齡期枝條對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌的抗病性研究

程自振， 趙 旭， 董向麗， 王彩霞， 劉曉凡， 李保華

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院 山東省植物病蟲(chóng)害綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266109）

蘋(píng)果枝干輪紋病［Botryosphaeriadothidea（Moug.ex Fr.）Ces.et de Not.］俗稱粗皮病，是蘋(píng)果枝干上發(fā)生的重要病害。嚴(yán)重發(fā)生時(shí)，可削弱樹(shù)勢(shì)，甚至造成枝干枯死［1］。近年來(lái)，隨著‘富士’品種的大量栽培和套袋技術(shù)的應(yīng)用，枝干輪紋病的危害逐年加重。據(jù)2008年國(guó)立耘等調(diào)查，我國(guó)蘋(píng)果枝干輪紋病總體發(fā)病率達(dá)77.6%［2］。作為蘋(píng)果樹(shù)三大病害之一，輪紋病發(fā)生的輕重，成為影響我國(guó)蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)能否可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素。

對(duì)于輪紋病，目前生產(chǎn)上以化學(xué)防治為主。研究枝條的生長(zhǎng)發(fā)育期和齡期對(duì)輪紋病菌侵染的影響，可以明確輪紋病菌在枝條上的侵染期和侵染部位，有助于更深入地了解輪紋病的發(fā)生和流行規(guī)律，為輪紋病的化學(xué)防治提供更可靠的理論依據(jù)，同時(shí)，也對(duì)抗病品種的鑒定和選育具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 病原菌

試驗(yàn)所用輪紋病菌于2009年采自山東萊陽(yáng)水沐頭村的商用蘋(píng)果園，為‘富士’蘋(píng)果枝條病瘤上的單孢分離菌株，活化前在5℃的冰箱內(nèi)保存。

接種前，先在PDA培養(yǎng)基上活化菌種，并接種‘富士’蘋(píng)果的幼果，繁殖分生孢子［3］。將新鮮的分生孢子用純凈水配制成孢子含量105個(gè)／m L的懸浮液，加入0.1%的吐溫20后備用?；?qū)⒒罨N繼代培養(yǎng)5 d，用直徑1.2 cm的打孔器從菌落邊緣打取菌餅，直接用于枝條接種。

1.2 當(dāng)年生枝條對(duì)輪紋病菌的抗病性

為了明確當(dāng)年生蘋(píng)果枝條在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段對(duì)輪紋病菌的抗性，2011年6月下旬和7月下旬，在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)果園內(nèi)5年生的‘富士’蘋(píng)果樹(shù)上，用輪紋病菌分兩批接種當(dāng)年生‘富士’蘋(píng)果枝條。接種時(shí)，選取10枝30～60 cm長(zhǎng)的當(dāng)年生、長(zhǎng)勢(shì)旺盛的健壯枝條，并標(biāo)記。病菌接種采用噴霧法。用手持噴霧器將孢子懸浮液均勻地噴灑到接種標(biāo)記枝條上，直到枝條上有孢子懸浮液流下為止。接種后迅速套上塑料袋，保濕24 h后解袋。接種后將接種枝條按長(zhǎng)度均勻分成10段，從基部到梢部依次編號(hào)為1～10。

11月份，待接種枝條發(fā)病后，調(diào)查記錄每一段枝條上的皮孔總數(shù)和發(fā)病的皮孔數(shù)。由于不同枝段上皮孔的密度差異較大，本研究以皮孔的發(fā)病率作為枝條抗侵入能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)。皮孔的發(fā)病率（%）＝100×該段發(fā)病皮孔數(shù)／該段總皮孔數(shù)。

1.3 不同齡期枝條對(duì)輪紋病菌的抗病性

為了研究不同齡期枝條對(duì)輪紋病菌的抗病性差異，2010年7月中旬和8月中旬，用輪紋病菌分兩批對(duì)1～5年生的‘富士’蘋(píng)果枝條進(jìn)行了接種。接種試驗(yàn)在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)果園內(nèi)6年生的‘富士’蘋(píng)果樹(shù)上進(jìn)行。接種時(shí)，分別選取1、2、3、4年和5年生枝條各10枝，并標(biāo)記。每個(gè)齡期枝條要求長(zhǎng)勢(shì)旺盛、表面無(wú)病瘤和病斑，且接種點(diǎn)處粗度基本一致。接種前，在每個(gè)枝條的中部選取2個(gè)接種點(diǎn)，其中1年生枝條接種位置在枝條的中下部，兩接種點(diǎn)之間的距離不小于5 cm，對(duì)接種區(qū)域表皮用70%的乙醇擦拭消毒，待乙醇完全揮發(fā)后，在兩個(gè)接種點(diǎn)上分別用菌餅和蘸有孢子懸浮液的脫脂棉接種。其中上部接種點(diǎn)上粘貼菌餅，菌絲面緊貼枝條的表皮；下部接種點(diǎn)放蘸有孢子懸浮液的脫脂棉球。接種后立即用保鮮膜將菌餅和蘸有孢子懸浮液的脫脂棉球包嚴(yán)。5 d后去掉保鮮膜，解除保濕。

次年6月，待接種枝條全部發(fā)病后，在菌餅接種的部位，以接種點(diǎn)為中心，選取直徑1.5 cm圓形區(qū)域用記號(hào)筆標(biāo)出，調(diào)查該區(qū)域內(nèi)皮孔總數(shù)和產(chǎn)生輪紋病瘤的皮孔數(shù)。在用分生孢子接種的部位，以發(fā)病最嚴(yán)重的區(qū)域?yàn)橹行模瑢?duì)于1年生的枝條，量取2 cm的枝段，對(duì)2～5年生枝條量取2 cm×2 cm的正方形區(qū)域并標(biāo)記，調(diào)查該枝段或區(qū)域內(nèi)皮孔總數(shù)和產(chǎn)生輪紋病瘤的皮孔數(shù)，計(jì)算皮孔的發(fā)病率。

2 結(jié)果與分析

2.1 當(dāng)年生枝條對(duì)輪紋病菌的抗病性

2011年6月下旬接種的當(dāng)年生枝條自8月中旬開(kāi)始發(fā)病，潛育期為50 d。7月下旬接種的當(dāng)年生枝條自8月下旬開(kāi)始發(fā)病，潛育期為30 d。進(jìn)入11月份皮孔的發(fā)病率不再增加。兩次接種枝條的皮孔發(fā)病率見(jiàn)表1。結(jié)果表明，在用輪紋病菌孢子接種的當(dāng)年生‘富士’蘋(píng)果枝條上，從基部到梢部，皮孔發(fā)病率逐漸升高，差異顯著。其中，6月下旬接種的8個(gè)枝條中（2個(gè)接種枝條被折斷），基部皮孔的平均發(fā)病率為37.51%，梢部皮孔的平均發(fā)病率為84.44%，從基部到梢部皮孔發(fā)病率有顯著增加（P＜0.05）。7月下旬接種的10個(gè)枝條中，調(diào)查只剩8個(gè)枝條，8個(gè)枝條基部皮孔的平均發(fā)病率為32.38%，梢部皮孔的發(fā)病率為58.57%，皮孔發(fā)病率的增加趨勢(shì)沒(méi)有6月下旬接種枝條的增加趨勢(shì)明顯。6月下旬和7月下旬兩次接種枝條皮孔的平均發(fā)病率分別為56.51%和43.64%，兩者差異顯著（P＜0.05）。

2.2 不同齡期枝條對(duì)輪紋病菌的抗病性

2010年7月中旬接種的枝條于9月開(kāi)始出現(xiàn)病瘤。8月中旬接種的枝條于10月開(kāi)始出現(xiàn)病瘤，但當(dāng)年形成的病瘤數(shù)量很少，大部分病瘤都在次年5月產(chǎn)生，6月病瘤數(shù)量基本不再增加。2011年6月中旬調(diào)查接種枝條的皮孔發(fā)病率見(jiàn)表2。7月中旬，用菌餅和分生孢子接種的1～5年生枝條上，皮孔的平均發(fā)病率分別為16.75%和26.90%，不同齡期枝條上的皮孔發(fā)病率沒(méi)有顯著的差異（P＞0.05）。表明1～5年生‘富士’蘋(píng)果枝條對(duì)輪紋病菌的抗侵染能力在7月中旬病菌接種時(shí)沒(méi)有顯著差異。8月中旬，用菌餅接種的枝條中，1年生枝條上的皮孔發(fā)病率為68.30%，顯著（P＜0.05）高于4年生和5年生枝條上的發(fā)病率31.77%和27.23%；用分生孢子接種的枝條中，1年生和2年生枝條的發(fā)病率分別為66.04%和64.40%，顯著高于5年生枝條的發(fā)病率30.89%。說(shuō)明1年生‘富士’蘋(píng)果枝條在8月中旬病菌接種時(shí)比5年生枝條更敏感，不同齡期的枝條對(duì)輪紋病菌的抗侵入能力存在一定差異。

表1 用輪紋病菌分生孢子接種當(dāng)年生枝條的皮孔發(fā)病率1）Table 1 Percentage of diseased lenticels on new produce‘Fuji’apple shoots inoculated with conidia of Botryosphaeria dothidea

表2 在不同時(shí)期用孢子和菌餅接種‘富士’蘋(píng)果1～5年生枝條的皮孔發(fā)病率1）Table 2 Percentage of diseased lenticels on 1－5 years’old‘Fuji’branches inoculated with conidia and mycelium of B.dothidea

3 結(jié)論與討論

輪紋病菌的分生孢子和菌絲接種結(jié)果表明，當(dāng)年生的‘富士’蘋(píng)果枝條對(duì)輪紋病菌從皮孔或氣孔侵入的抗性存在顯著差異。新生枝條抗侵入能力差，對(duì)輪紋病菌敏感，隨枝條的生長(zhǎng)發(fā)育，抗病性逐漸增強(qiáng)，新生枝條生長(zhǎng)至2個(gè)月后，達(dá)到成年枝條的抗性。從不同齡期的枝條接種輪紋病菌后皮孔的發(fā)病率可以看出，7月份，‘富士’蘋(píng)果1～5年生成年枝條對(duì)輪紋病菌抗侵入的能力沒(méi)有顯著的差異。但8月份，1年生的低齡枝條對(duì)輪紋病菌的侵染比5年生的高齡枝條更敏感。

蘋(píng)果輪紋病菌主要通過(guò)皮孔、傷口或表皮縫隙侵入枝干［4］。氣孔和皮孔是輪紋病菌的主要侵染途徑，從氣孔和皮孔侵染的病原菌量約占輪紋病菌在枝干上總侵染量的92%，通過(guò)傷口及表皮縫隙侵染菌量，僅占輪紋病菌總侵染量的8%［5］。輪紋病菌在健康的枝條上主要從皮孔和氣孔侵染，氣孔和皮孔是阻止輪紋病菌侵染健康枝條的第一道屏障。

而新生枝條和幼果上只有氣孔，沒(méi)有皮孔，皮孔是在枝條或果實(shí)的生長(zhǎng)后期由氣孔發(fā)育而成。氣孔由兩個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞組成，內(nèi)部為薄壁細(xì)胞。這一結(jié)構(gòu)難以抵御輪紋病菌的侵染。發(fā)育成熟的皮孔有三層結(jié)構(gòu)：上層覆蓋死細(xì)胞層，其下為2～3層木栓化的細(xì)胞，內(nèi)層為具有分生能力的薄壁組織。輪紋病菌只有穿透皮孔結(jié)構(gòu)的木栓化細(xì)胞才能侵入皮層內(nèi)部［6］。皮孔的發(fā)育是漸變的過(guò)程。皮孔發(fā)育初期，木栓組織還沒(méi)有形成，對(duì)輪紋病菌的抗性較弱。皮孔發(fā)育中后期木栓層才形成［7］，皮孔的抗病性也逐漸增強(qiáng)。幼嫩枝條經(jīng)2個(gè)月左右的生長(zhǎng)發(fā)育，才能達(dá)到成熟枝條的抗性。

蘋(píng)果枝條對(duì)輪紋病菌的抗侵染能力主要取決于皮孔的結(jié)構(gòu)，如木栓化細(xì)胞層數(shù)、細(xì)胞大小和排列致密的程度等。對(duì)于同一蘋(píng)果品種，無(wú)論枝條的齡期大小，成熟枝條上的皮孔結(jié)構(gòu)基本一致，對(duì)輪紋病菌的抗侵入能力也不會(huì)有顯著的差異。

然而，枝條為了保持正常呼吸，皮孔細(xì)胞就需要不斷更新，而且隨枝條的生長(zhǎng)而擴(kuò)大。皮孔內(nèi)部的分生組織能不斷地分化產(chǎn)生新的細(xì)胞，更新其木栓化細(xì)胞，而原有的木栓化細(xì)胞死亡脫落或覆蓋在皮孔表面。皮孔細(xì)胞的更新，對(duì)其抗性影響不大。但是皮孔的生長(zhǎng)與擴(kuò)大對(duì)其抗侵染能力影響較大。8月份，1年生枝條比5年生枝條對(duì)輪紋病菌的侵染更加敏感，可能與皮孔的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。8月份，當(dāng)枝條迅速加粗生長(zhǎng)時(shí)，皮孔自邊緣產(chǎn)生新的薄壁細(xì)胞，并木栓化。在薄壁細(xì)胞完全木栓化之前，皮孔對(duì)輪紋病菌的侵染較為敏感。枝條加粗生長(zhǎng)速度越快，皮孔新增面積也越大，對(duì)輪紋病菌的抗侵染能力就越差。與5年生枝條相比，1年枝條皮孔的結(jié)構(gòu)變化更大，也就更容易遭受輪紋病菌的侵染。

本試驗(yàn)采用了孢子和菌絲兩種方式接種，試驗(yàn)結(jié)果表明，用孢子接種的枝條發(fā)病率更高。在自然條件下，輪紋病菌主要以分生孢子和子囊孢子傳播侵染，用孢子接種更接近于輪紋病菌的田間發(fā)病規(guī)律。用孢子接種用于抗性鑒定，更能準(zhǔn)確地反映不同蘋(píng)果品種對(duì)輪紋病菌的抗性。

蘋(píng)果樹(shù)的大部分枝條都在5月形成，7月以后逐漸成熟。因此，5－7月是當(dāng)年生蘋(píng)果枝條對(duì)輪紋病菌的最敏感時(shí)期，在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)注意這一時(shí)期枝干輪紋病的防治。在果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，其抗病性的變化是否也存在類似的現(xiàn)象，有待于深入研究。在蘋(píng)果枝干上，只要有皮孔存在，就存在輪紋病菌侵染的可能，就不能忽視對(duì)輪紋病的防治，尤其是8月枝條迅速加粗生長(zhǎng)期。

［1］董金皋.農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007：253－256.

［2］國(guó)立耘，李金云，李保華，等.中國(guó)蘋(píng)果枝干輪紋病發(fā)生和防治情況［J］.植物保護(hù)，2009，35（4）：120－123.

［3］冷偉峰，李保華，國(guó)立耘，等.蘋(píng)果輪紋病菌誘導(dǎo)產(chǎn)孢方法［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2009，39（5）：536－539.

［4］陳策.蘋(píng)果果實(shí)輪紋病研究進(jìn)展［J］.植物病理學(xué)報(bào)，1999，29（3）：193－198.

［5］李廣旭，高艷敏，楊華，等.輪紋病菌在蘋(píng)果枝干上侵入途徑的掃描電鏡觀察［J］.果樹(shù)學(xué)報(bào)，2005，22（2）：169－171.

［6］張高雷，李保華，董向麗，等.蘋(píng)果輪紋病瘤組織形態(tài)研究［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2011，41（1）：98－101.

［7］李廣旭，沈永波，高艷敏，等.皮孔組織結(jié)構(gòu)及密度與蘋(píng)果枝干粗皮病發(fā)生的關(guān)系［J］.果樹(shù)學(xué)報(bào)，2004，21（4）：350－353.