黑龍江省冬小麥雪腐病病原鑒定及生物學特性研究

代麗婷， 劉 東， 張艷菊

（東北農業(yè)大學農學院，哈爾濱 150030）

‘東農冬麥1號’是在黑龍江省冬季嚴寒條件下，利用品種間雜交育成的超強冬性抗寒新品種，已實現(xiàn)在黑龍江一些地區(qū)穩(wěn)定安全越冬，打破了冬小麥不能在黑龍江播種的歷史，改寫了黑龍江省傳統(tǒng)的一年一熟的種植制度。冬小麥具有生育期長、產量潛力高和提早成熟等特點，在黑龍江省冬麥秋播既緩解了農時，解決了春澇播不上種的問題，又可以有效提高黑龍江省小麥單產水平，實現(xiàn)黑龍江省部分地區(qū)兩年三熟種植，提高土地利用效率，對黑龍江省種植結構的調整具有深遠意義［1］。但是，隨著冬小麥在黑龍江省種植面積的擴大，一些植物病害的發(fā)生給冬小麥的生產造成了一定影響，其中雪腐病就是危害冬小麥生產的重要病害之一。在冬末春初，冬小麥剛返青時，積雪較多的地區(qū)由于雪腐病的發(fā)生，造成麥苗成條成塊枯萎，死亡率極高，直接影響產量。2011年4月，作者在黑龍江省饒河縣冬小麥種植區(qū)發(fā)現(xiàn)有苗枯的癥狀發(fā)生，冬麥苗成條成塊枯萎死亡，病苗生長衰弱，根系不發(fā)達或短，苗矮，發(fā)病重時整株呈水浸狀變褐腐爛或死亡，發(fā)病率為10%～30%，嚴重的可達50%。作者在發(fā)生上述癥狀的冬小麥田采集病樣，進行了病菌的分離、鑒定以及生物學特性研究，以期為病害的防治提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

從黑龍江省饒河縣青山村采集冬小麥病樣，采用常規(guī)組織分離法［2］進行分離。剪取5mm×5mm病健交界處葉片，先在75%乙醇中浸8～10s，再用0.1%升汞溶液消毒30s，滅菌水沖洗3～4次后，用滅菌濾紙吸干水分，置于含有鏈霉素的PDA、PSA培養(yǎng)基中，15℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。單孢純化后保存于PDA斜面上備用。

1.2 病原鑒定

1.2.1 病原菌的形態(tài)觀察

挑取經單孢純化后的菌絲，分別接種于PSA和SNA兩種培養(yǎng)基上，25℃恒溫光照培養(yǎng)箱內12h光照與黑暗交替培養(yǎng)，記錄在PSA上培養(yǎng)4d和7d的菌落直徑大小，顏色變化；大、小型分生孢子和厚垣孢子的有無及大小、形狀和著生方式等情況。參考Booth（1971）、Nelson（1983）、Leslie ＆ Summerell（2006）［3－5］等資料及真菌鑒定手冊［6］進行鑒定。

1.2.2 致病性測定

冬小麥品種‘東農冬麥1號’播種于25cm×40cm播種盤內，25℃光暗交替培養(yǎng)至2～3片葉時采用噴霧法進行接種。將單孢分離的菌株移入PL培養(yǎng)液（馬鈴薯200g，乳糖20g，蒸餾水1 000mL）內，振蕩培養(yǎng)7d后，配制成孢子含量4×106個／mL的菌懸液接種體，均勻噴霧于小麥葉片上。接種后置于18℃、12h8 000～10 000lx光暗交替培養(yǎng)，套袋保濕3d，7d后調查發(fā)病情況。以接種無菌水為對照。按照柯赫氏法則，從接種后發(fā)病的植株上再進行病原菌分離以及再次接種，以確定分離物是否為致病菌。

1.3 病原菌生物學特性

1.3.1 溫度對菌絲生長和產孢量的影響

菌餅接種到PDA培養(yǎng)基上，分別于5、10、15、20、25、30℃條件下光暗交替培養(yǎng)，7d后測量菌落直徑，每個處理3次重復。10d后測產孢量：每皿倒入等量無菌水，刮下菌落，用紗布過濾，濾液在1 500r／min的離心機上離心20min，倒去上清液，沉淀物用10mL無菌水稀釋，計算產孢量［2］。用新復極差法 （Duncan法）進行差異顯著性分析。

1.3.2 病原菌致死溫度的測定

菌餅置于滅菌離心管底部，分別于35、40、45、50、55、60、65℃處理10min，然后置于PDA平板中央，每處理3次重復，25℃培養(yǎng)5d，觀察菌絲在PDA平板的生長情況［7］。

1.3.3 光照對菌絲生長和產孢量的影響

將菌餅接種到PDA培養(yǎng)基上，分別置于全光照、12h光暗交替、全黑暗，25℃條件下培養(yǎng)，每個處理重復3次。7d后測量菌落直徑，觀察氣生菌絲及菌落的形態(tài)和顏色。10d后測產孢量（方法同1.3.1）。

1.3.4 pH對菌絲生長和產孢量的影響

用1mol／L的HCl和NaOH調節(jié)配制pH為2.5、3.5、5.0、6.0、7.0、9.0、10.5、11.5的 PDA 培養(yǎng)基，將菌餅移植于PDA平板中央，25℃光暗交替培養(yǎng)，7d后測量菌落直徑，每個處理3次重復。10d后測產孢量（方法同1.3.1）。

1.3.5 營養(yǎng)成分對菌絲生長和產孢量的影響

基礎培養(yǎng)基采用查彼克（Czapek）培養(yǎng)基：NaNO32g、KCl 0.5g、FeSO40.01g、K2HPO41.0g、MgSO40.5g、蔗糖30g、瓊脂17g。碳源用葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘油、可溶性淀粉替代培養(yǎng)基中的蔗糖；氮源用 NH4NO3、KNO3、（NH4）2SO4、牛肉膏、蛋白胨替代基礎培養(yǎng)基中的NaNO3。將菌餅移植于上述培養(yǎng)基中，25℃光暗交替培養(yǎng)，7d后測菌落直徑，觀察氣生菌絲及菌落的形態(tài)和顏色［8］。10d后測產孢量。

1.3.6 礦質營養(yǎng)元素對菌絲生長和產孢量的影響

完全培養(yǎng)液為蔗糖10g，50%NH4NO36mL，KH2PO40.51g，MgSO40.75g，F(xiàn)eSO40.015g。缺N用0.17g NaCl代替完全培養(yǎng)液中的NH4NO3；缺C用0.17g NaCl代替蔗糖；缺P用0.255g KCl代替 KH2PO4；缺 Fe用 0.015g NaSO4代替FeSO4；缺 K用0.51g NaH2PO4代替 KH2PO4；缺Mg用0.75g Na2SO4代替MgSO4。上述營養(yǎng)液每100mL加入1.8g瓊脂粉配成固體培養(yǎng)基。菌餅移植于上述培養(yǎng)基平板中央，25℃恒溫光暗交替培養(yǎng)，7d后測量菌落直徑，觀察氣生菌絲及菌落的形態(tài)和顏色［9］。10d后測產孢量。

2 結果與分析

2.1 田間癥狀

雪腐病主要發(fā)生在連作地塊，在積雪融化時癥狀最明顯。重的地塊冬麥苗成條成塊的枯萎死亡（圖1a）。發(fā)病植株葉片染病初呈水浸狀，后擴展為橢圓形至圓形大斑。發(fā)生在葉緣的多呈半圓形，大小1～4cm，邊緣灰色，葉間污褐色，呈浸潤性地向四周擴展，形成不十分明顯的輪紋數層，病斑上可見磚紅色霉狀物（圖1b）。濕度大時病斑邊緣現(xiàn)白色菌絲層。病苗基部的葉鞘變褐壞死，且向葉片基部發(fā)展，致整葉變褐或變黃枯死。病苗生長衰弱，根系不發(fā)達或短，苗矮，第1、2葉短縮，發(fā)病重時整株呈水浸狀變褐腐爛或死亡，死苗倒伏，表面生白色菌絲。

圖1 小麥雪腐病發(fā)病癥狀Fig.1 Symptoms of the winter wheat snow mold

2.2 病原鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)特征

在PSA培養(yǎng)基25℃光暗交替條件下，48h菌落直徑為16.5mm。剛長出的菌絲為白色，后在培養(yǎng)基上菌落依菌株不同有橙黃色、粉紅色或杏仁黃（圖2）。在光暗交替條件下，菌落形成同心環(huán)，邊緣整齊，菌絲體稀疏或致密，向上生長呈羊毛狀或平鋪生長呈氈狀，在培養(yǎng)基表面生成大量橘黃色黏分生孢子團，氣生菌絲亦能產孢。培養(yǎng)5d后在顯微鏡下觀察小型分生孢子數量不多，長橢圓形、卵形或腎形，無色（圖3a）；大型分生孢子新月形，兩端鈍圓，無腳胞，無色，具隔膜0～3個，有時較多4～7個，以1個和3個隔膜居多，無隔膜的大?。?.3～12.8）μm×（2.0～2.8）μm，1個的（10.3～17.8）μm×（2.3～3.3）μm，2～3個的（15.3～30.8）μm×（2.3～3.8）μm，4～7個的（19.3～37.8）μm×（2.5～4.0）μm（圖3b～g）；分生孢子梗短而直，無隔，棍棒狀，大小（5.0～11.0）μm×（3.0～5.0）μm；產孢細胞瓶狀或倒梨形，端部較長，有環(huán)痕，大?。?.0～10.0）μm×（2.5～4.0）μm。

圖2 小麥雪腐病病菌菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of the winter wheat snow mold

圖3 小麥雪腐病病菌形態(tài)Fig.3 Morphology of the pathogen causing the winter wheat snow mold

2.2.2 致病性測定

盆栽接種試驗顯示，在18℃培養(yǎng)7d后，幼葉上可見紡錘形或橢圓形病斑，病斑中央淡褐色，邊緣紅色，直徑2.0～3.0mm，有的呈水漬狀斑點，后期嚴重發(fā)病的葉片枯黃死亡，死亡葉片多由葉鞘和葉片基部發(fā)病，迅速擴展使整個葉片褐腐或變黃枯死。枯死葉片表面有白色菌絲蔓延，使葉片與葉片之間相互連接。有的葉片上產生粉紅色分生孢子，后期死葉成粉紅色。發(fā)病癥狀與田間癥狀一致，從接種發(fā)病的植株病部可重新分離獲得病原菌，并與所接種的病原菌一致，再次接種得到相同的結果，因此確定此病原菌為致病菌。

2.3 病原菌生物學特性

2.3.1 溫度對菌絲生長和產孢量的影響

溫度對病原菌的生長具有顯著的影響。在5～30℃條件下菌株均能夠生長，在20～25℃時菌絲生長較快，顯著地高于其他的溫度處理。根據觀察，第7天時25℃菌絲生長最快，之后20℃比25℃的菌絲生長速率快。圖4為培養(yǎng)7d的菌落直徑，從圖中可以看出，菌絲生長最適溫度為20～25℃，其他4個溫度處理沒有顯著性差異，但30℃菌絲出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象。

10～25℃范圍內病原菌可以產孢，其中最適宜的產孢溫度為15℃，培養(yǎng)10d產孢量達到4.0×106個／mL。5℃和30℃時病原菌均不產孢（圖4）。

圖4 溫度對菌絲生長及產孢量的影響Fig.4 Effects of temperature on mycelial growth and spore production of the winter wheat snow mold

2.3.2 病原菌致死溫度的測定

病菌在35、40℃和45℃范圍內水浴10min，在恒溫箱中培養(yǎng)5d后，在培養(yǎng)基上均有菌落形成，直徑分別達到44、30、25mm；50℃以上的條件下在培養(yǎng)基上均沒有菌落形成，病原菌的致死溫度為50℃水浴10min。

2.3.3 光照對菌絲生長和產孢量的影響

在光暗交替（L∥D＝12h∥12h）的條件下，病原菌菌絲生長最快，培養(yǎng)7d后，菌落直徑達到61mm，產孢量也最高，為5.0×106個／mL，菌落呈鮮粉紅色，氣生菌絲致密；在全黑暗條件下，菌絲生長最慢，7d后菌落直徑為50mm，產孢量最低，為2.5×105個／mL，菌落呈暗粉色，氣生菌絲致密。但3個處理間菌絲生長沒有顯著性差異，而產孢量差異顯著（圖5）。

圖5 光照對菌絲生長及產孢量的影響Fig.5 Effects of light on mycelial growth and spore production of the winter wheat snow mold

2.3.4 pH對菌絲生長和產孢量的影響

菌絲在pH 2.5～11.5均能夠生長，但菌絲在pH 2.5時生長緩慢；pH 3.5～11.5范圍內菌落直徑沒有顯著性差異，pH為7時菌絲生長最快，培養(yǎng)7d后，菌落直徑達到40mm。病原菌在pH為5～10.5范圍內能夠產孢，產孢的最適pH為6～7，在pH為7時產孢量最大，為3.7×106個／mL（圖6）。

圖6 pH對菌絲生長及產孢量的影響Fig.6 Effects of pH on mycelial growth and spore production of the winter wheat snow mold

2.3.5 碳源對菌絲生長和產孢量的影響

病菌在以淀粉為碳源的培養(yǎng)基上生長最快，在甘油和麥芽糖上生長較慢，生長量的大小依次為：淀粉＞蔗糖＞葡萄糖＞乳糖＞麥芽糖＞甘油。雖然病菌在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長相對較慢，但產孢最多，為3.6×106個／mL，產孢量最少的為乳糖，為1.3×106個／mL，方差分析表明，不同碳源對產孢量的影響差異顯著（圖7）。不同碳源培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)均屬于致密型。

圖7 不同碳源對菌絲生長及產孢量的影響Fig.7 Effects of different carbon sources on mycelial growth and spore production of the winter wheat snow mold

2.3.6 氮源對菌絲生長和產孢量的影響

病菌在以牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基上生長最快，顯著高于其他處理，而在以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上最慢，其他4個處理差異不十分顯著；在以硝酸鈉為氮源的Czapek培養(yǎng)基上產孢最多，為2.8×106個／mL，在以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上不產孢（圖8）。不同氮源培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)不同，有蛋白胨的培養(yǎng)基菌落較稀疏，有牛肉膏的培養(yǎng)基菌落稀疏，其他均屬于致密型。

圖8 不同氮源對菌絲生長及產孢量的影響Fig.8 Effects of different nitrogen sources on mycelial growth and spore production of the winter wheat snow mold

2.3.7 礦質營養(yǎng)元素對菌絲生長的影響

病菌在完全營養(yǎng)液中生長最好，第7天菌落直徑達到37mm，顯著高于其他處理；缺P、Mg的處理次之，在缺N、C的處理中生長最慢，說明缺N、C對病菌菌絲生長影響較大（圖9）。在這7個處理中病菌都沒有產生孢子。缺N、缺C和缺P的培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)稀疏，其他均屬于致密型。

圖9 礦質營養(yǎng)對菌絲生長的影響Fig.9 Effects of mineral nutrients on mycelial growth of the winter wheat snow mold

3 結論與討論

本文根據病菌形態(tài)特征和致病性分析，將黑龍江省饒河縣采集的小麥雪腐病鑒定為半知菌亞門雪腐格氏霉Gerlachia nivale （Ces.ex Sacc.）W.Gams.et E.Mull.［異名 Fusarium nivale （Fr.）Ces.或 Microdochium nivale（Fr.）Samuels ＆ Hallet］，有性世代為雪腐小畫線殼［Monographella nivalis （Schaffn.）Mull.］侵染引起的紅色雪腐病。小麥雪腐（霉）?。╳heat snow molds）又名雪霉葉枯病、雪腐葉枯?。?0］，是由多種耐低溫病原菌侵染引起、危害小麥幼苗、導致苗腐的一類病害。雪腐病菌是一類菌的名字，它包括不同分類單位的真菌，包括藻界卵菌綱的Pythium iwayamai Ito、P.okanoganense Lipps、P.paddicum Harane；子囊菌亞門的 Microdochium nivale （teleomorph：Monographella nivalis，syn.Fusarium nivale）、Phacidium infestans、Racodium therryanum、Sclerotinia borealis （syn.Myriosclerotinia borealis）、S.nivalis、S.trifoliorum、S.kitajimana；擔子菌亞門的 Coprinus psychromorbidus、Typhula incarnata、T.ishikariensis（syn.T.idahoensis）和半知菌亞門的Gerlachia nivalis［11］。紅色雪腐病和雪霉葉枯病是同一種病原菌在不同生態(tài)條件和在寄主不同生育階段引起的兩種癥狀類型［12］。此病自1972年以來在墨西哥、英國、日本、朝鮮等國就已經報道發(fā)生［13－16］，在國內最早于1961年在陜西發(fā)現(xiàn)，20世紀80年代初才正式報道，迄今在青海、甘肅、新疆、四川、貴州、湖北和江蘇、浙江等省都有發(fā)生［17］，新疆北部發(fā)生較多［18］，在黑龍江省是新發(fā)生的一種病害，尚屬首次報道。

病菌生物學特性研究結果表明，菌絲生長的最適宜溫度為20～25℃，最適pH為7，在光暗交替（L∥D＝12h∥12h）條件下，菌絲生長最快；最適碳源為淀粉，最適氮源為牛肉膏，在完全營養(yǎng)液中生長最好，缺N、C對病菌生長影響較大，該結果與1986年舒正義報道過的關于雪霉葉枯病菌的礦質營養(yǎng)的研究基本一致［9］；病菌的致死溫度為50℃10min。

病菌最適宜的產孢溫度為15℃，5℃和30℃時均不產孢；產孢的最適pH為6～7，pH為7時產孢量最大；光暗交替的條件有利于產孢；在以麥芽糖為碳源、硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基上有利于產孢。

本文通過對黑龍江省冬小麥雪腐病病原種類的鑒定以及病菌生物學特性的研究，為闡明病菌生長與環(huán)境條件的關系，進一步明確雪腐病在黑龍江省的發(fā)生規(guī)律以及病害綜合防治提供一定的理論依據。

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