河南省五種常見禾本科雜草病原真菌種類調(diào)查與部分菌株的致病性測定

趙杏利， 牛永春， 鄧 暉

（農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081）

禾本科、菊科、十字花科是雜草最集中的三大科，而且稗草、馬唐、狗尾草等禾本科雜草常伴生在水稻、大豆、小麥、玉米等主要農(nóng)作物田中，危害很大［1］。近年來，隨著種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，肥水條件的變化，以及大面積長期使用除草劑，使得農(nóng)田雜草的群落和結(jié)構(gòu)發(fā)生了相應(yīng)的變化，禾本科雜草危害日趨嚴(yán)重，嚴(yán)重影響了作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。利用從雜草病株分離篩選出來的植物病原菌防治雜草是開發(fā)新型生物除草劑的重要途徑。其中，有不少成功的例證，如中國的魯保一號，荷蘭的Biochon等［2］。對雜草病原真菌種類的調(diào)查將使我們了解雜草的病原真菌種類狀況、為利用雜草致病菌研發(fā)生物除草劑提供基礎(chǔ)和材料。潘麗梅等［3］調(diào)查了東北地區(qū)14科26屬雜草上的病原真菌，何偉等［4］調(diào)查了東北地區(qū)4種常見禾本科雜草上的病原真菌，楊葉等［5］調(diào)查了海南省17種雜草上的病原真菌。關(guān)于河南省雜草病原真菌種類的調(diào)查，張希福［6］鑒定了豫北地區(qū)19種雜草上的30種病原真菌，其中有5種病原真菌來自禾本科雜草；張猛等［7］從禾本科雜草上分離鑒定了9種蠕形分生孢子真菌，其中包括分別來自狗尾草、馬唐、狗牙根和牛筋草的5種平臍蠕孢屬真菌，分別來自馬唐和牛筋草的3種彎孢屬真菌，來自稗草的1種凸臍蠕孢屬真菌。對于這些真菌的致病性這兩篇報道中均未進(jìn)行測定。本文針對河南省常見禾本科雜草，在對其真菌病害進(jìn)行多地調(diào)查、采樣的基礎(chǔ)上，對所有病害樣本進(jìn)行了分離鑒定，并對部分菌株進(jìn)行了致病性測定。

1 材料和方法

1.1 病害調(diào)查

于2007年10月和2008年7月對河南省的信陽、南陽、洛陽、鞏義、三門峽、鄭州、開封、新鄉(xiāng)、焦作等地的農(nóng)田和草坪中的狗尾草、馬唐、牛筋草、稗草、虎尾草5種常見禾本科雜草真菌病害的種類、癥狀及發(fā)生程度等進(jìn)行調(diào)查。

1.2 樣本采集

調(diào)查過程中，對隨時采集的發(fā)病禾本科雜草的葉片和莖稈進(jìn)行現(xiàn)場拍照，并記錄寄主名稱、采集地點(diǎn)、采集地生境、采集人姓名和采集日期及采集地坐標(biāo)等信息。對于采集的樣本及時用吸水紙壓制使之盡快干燥。

1.3 病原真菌的分離

從發(fā)病部位的病健交界處切取5 mm2左右的組織塊，用0.1%升汞溶液進(jìn)行表面消毒3 min，無菌水沖洗3次，移入PDA培養(yǎng)基平板上，26℃恒溫箱中培養(yǎng)。待菌落長出后，從組織塊菌落邊緣挑取少量菌絲，再次移入PDA平板上培養(yǎng)。經(jīng)過移植純化，菌落形態(tài)和孢子形態(tài)均一致的菌株移入PDA斜面培養(yǎng)，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病原真菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株接種在PDA培養(yǎng)基平板上，26℃恒溫培養(yǎng)7 d，記錄菌落形態(tài)，觀察記錄孢子形態(tài)及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，測量孢子（30個）和孢子梗大小等，查閱專著文獻(xiàn)［8－10］進(jìn)行鑒定。對在PDA平板上不易產(chǎn)孢的菌株，重新接種于水瓊脂培養(yǎng)基上，兩周后制作玻片進(jìn)行顯微觀察。

1.4.2 DNA提取、r DNA ITS的PCR擴(kuò)增及序列分析

在PDA平板上鋪一層玻璃紙，然后把供試菌株接種到玻璃紙上，待菌落接近長滿平板時從玻璃紙上收獲菌絲體，用SDS法提取基因組DNA［11］，采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和濃度。

以提取的基因組DNA為模板，用引物ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）和 ITS5（5′－GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG－3′）［12］對供試菌株r DNA的ITS區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)液體積50μL，包括：10×PCR 緩沖液（p H 8.8 100 mmol／L Tris－HCl，500 mmol／L KCl，0.8%Nonidet P－40 5μL，25 mmol／L MgCl25μL，引物ITS4（10μmol／L）和ITS5（10μmol／L）各1μL，10 mmol／L d NTP 2μL，5 U／μLTaqDNA聚合酶0.4μL，基因組 DNA 1μL （1g／L），雙蒸滅菌水34.6μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2 min后，95℃變性1 min，53℃復(fù)性1 min，72℃延伸2 min，進(jìn)行34個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳分離后，于溴化乙錠溶液（0.5μg／m L）中染色10 min，通過 ALPHA凝膠成像系統(tǒng)顯示記錄電泳結(jié)果。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)檢測后送到上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，測序引物為ITS5。將測得的序列采用Blast程序與GenBank上的序列進(jìn)行相似性比較。

1.5 致病性測定

1.5.1 孢子懸浮液的制備

選取樣品發(fā)病嚴(yán)重、在PDA培養(yǎng)基上易于產(chǎn)孢、且產(chǎn)孢量大的菌株，把各菌株分別接種在PDA平板上，于26℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)黑暗培養(yǎng)7～10 d，檢測產(chǎn)孢情況。待產(chǎn)孢較多時，加適量滅菌水于培養(yǎng)皿中，將菌落用玻片輕輕刮下，懸浮液經(jīng)兩層滅菌紗布過濾，收集孢子懸浮液。將各菌株的孢子懸浮液分別調(diào)整至濃度為105個孢子／m L，加0.05%吐溫－80混勻待用。

1.5.2 供試植株的培育

將狗尾草、馬唐、牛筋草、稗草、虎尾草等植株較小的禾本科雜草播種于直徑7.5 cm的塑料花盆中，將小麥、玉米、高粱、谷子、棉花、番茄、黃瓜、大豆、花生等植株較大的作物播種于直徑15 cm的塑料花盆中。根據(jù)接種菌株的數(shù)量，按每菌株接種每種植物3盆準(zhǔn)備供試植物。在溫度為20～30℃的溫室中培育植株，待長至2～4片真葉期，根據(jù)供試植物的植株大小每盆保留5～10株待用。

1.5.3 接種方法

采用孢子懸浮液噴霧法接種，用微型噴霧器將混勻的孢子懸浮液均勻噴灑到待接種的植株上，每個菌株接種供試植物3盆，每種供試植物留3盆噴含0.05%吐溫－80的無菌水作對照，共接種30個菌株。接種的植株置于密閉容器內(nèi)室溫下保濕培養(yǎng)24 h，然后移到人工氣候箱中培養(yǎng)，每天光照12 h，光照度16500 lx，溫度32℃／25℃（光照／黑暗）、相對濕度（80±5）%。

1.5.4 病情調(diào)查

接種一周后調(diào)查發(fā)病情況，病情分級標(biāo)準(zhǔn)：NS，無癥狀；LS，有零星病斑；MS，病斑較大、較多；SS，病斑遍布植物葉片，病斑融合，植株死亡。

2 結(jié)果與分析

2.1 五種禾本科雜草上的真菌種類

狗尾草和馬唐在各調(diào)查地點(diǎn)分布普遍，葉和莖部發(fā)病很常見，局部發(fā)病嚴(yán)重，狗尾草上多為梭形褐斑，馬唐上多為近圓形褐斑。牛筋草、稗草在多數(shù)調(diào)查點(diǎn)都有分布，一般不成片發(fā)生，發(fā)病較輕，主要為條狀和不規(guī)則褐色葉斑。虎尾草一般局部成片發(fā)生，發(fā)病常見。共采集病害樣本72份，從中分離到152個菌株。共有131個菌株觀察到孢子，其中有82個菌株在PDA培養(yǎng)基上即可產(chǎn)孢，有49個菌株在PDA培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢但在水瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生了孢子。經(jīng)對產(chǎn)孢菌株的形態(tài)觀察和對70個菌株的ITS1－5.8S－ITS2序列分析，產(chǎn)孢菌株分屬于彎孢屬（Curvularia）、平臍蠕孢屬（Bipolaris）、凸臍蠕孢屬（Exserohilum）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma）、鐮孢屬（Fusarium）、黑孢屬（Nigrospora）、枝孢屬（Cladosporium），炭疽菌屬（Colletotrichum）和鏈格孢屬（Alternaria）等9個屬。鏈格孢屬真菌數(shù)量最多，有61株；其次是平臍蠕孢屬和彎孢屬，分別有28株和27株；其他各屬真菌數(shù)量比較少。鑒定到種的真菌有16種，分子鑒定結(jié)果和形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果相符合，與GenBank上相關(guān)種的序列相似性均在99%以上。其中平臍蠕孢屬真菌有5種：狗尾草平臍蠕孢［B.setariae（Saw.）Shoem.］、麥根腐平臍蠕孢［B.sorokiniana（Sacc.）Shoemaker］、甘蔗平臍蠕孢［B.sacchari（Butler）Shoem.］、玉蜀黍平臍蠕孢［B.maydis（Y.Nisik.＆ C.Miyake）Shoem］和多節(jié)平臍蠕孢［B.nodulosa（Berkeley et M.A.Curtis）Shoemaker］；彎孢屬真菌有3種：新月彎孢［Curvularialunata（Wakker）Boedijn］、間隔彎孢（C.intermediaBaedijn）和 香 茅 彎 孢 ［C.cymbopogonis（Dodge）Groves ＆Skolko］；凸臍蠕孢屬真菌有兩種：梭形凸臍蠕孢（E.fusiformeAloom）和嘴突凸臍蠕孢［E.rostratum（Dyechsler）K.S.Leonard ＆ Suggs］；鏈格孢屬真菌有兩種：密實(shí)鏈格孢［A.compacta（Cooke）Mcclellan］和 鏈格孢 ［A.alternata（Fr.）Keissl］（表1）。

除鏈格孢屬真菌在5種雜草上均能分離到外，其他真菌則只在1～3種雜草上分離到。其中新月彎孢僅在稗草上分離到，木賊鐮孢和多節(jié)平臍蠕孢僅在牛筋草上分離到，Phomasojicola、香茅彎孢和刺盤孢屬真菌僅在馬唐上分離到。除鏈格孢屬真菌在各雜草上出現(xiàn)的頻率較高外，稗草上的主要真菌為新月彎孢，狗尾草上的主要真菌為狗尾草平臍蠕孢，馬唐上的主要真菌為間隔彎孢、香茅彎孢，牛筋草上的主要真菌為多節(jié)平臍蠕孢（表1）。

表1 五種禾本科雜草上分離到的真菌種類和菌株數(shù)量Table 1 Species of fungi and number of strains isolated from 5 gramineous weeds

續(xù)表1 Table 1（Continued）

2.2 部分菌株的致病性

共對包括凸臍蠕孢屬4個菌株、彎孢屬7個菌株、枝孢屬1個菌株、平臍蠕孢屬11個菌株和鏈格孢屬7個菌株共30個菌株進(jìn)行了致病性測定。結(jié)果表明，絕大部分菌株均能引起寄主不同程度發(fā)病。其中平臍蠕孢屬所有菌株均能引起狗尾草和虎尾草不同程度發(fā)病，狗尾草平臍蠕孢NY1菌株能引起狗尾草、馬唐、虎尾草嚴(yán)重發(fā)病，ZZ2和XY2菌株能引起狗尾草和虎尾草中度發(fā)病。梭形突臍蠕孢zxl07333b菌株能引起稗草中度發(fā)病，新月彎孢zxl07289a菌株能引起虎尾草嚴(yán)重發(fā)病和稗草中度發(fā)病，間隔彎孢zxl07251a菌株能引起馬唐和虎尾草中度發(fā)病，鏈格孢zxl07254b菌株能引起狗尾草和虎尾草中度發(fā)病，其余凸臍蠕孢屬、彎孢屬、枝孢屬和鏈格孢屬菌株在5種雜草上均只引起輕度發(fā)病或不引起發(fā)病（表2）。

對能引起雜草嚴(yán)重發(fā)病的狗尾草平臍蠕孢菌株NY1和新月彎孢菌株zxl07289a進(jìn)行了初步寄主范圍測定，結(jié)果表明，兩個菌株在禾本科作物玉米、小麥和谷子上可引起一定程度發(fā)病，而在棉花、花生、大豆、黃瓜等雙子葉作物上則不引起任何病害。

表2 30個菌株對5種禾本科雜草的致病性測定1）Table 2 Pathogenicity of 30 isolates to 5 gramineous weeds

續(xù)表2 Table 2（Continued）

3 討論

蠕形分生孢子真菌是禾本科植物上的常見病原菌，主要包括平臍蠕孢屬（Bipolaris）、彎孢屬（Curvularia）、凸臍蠕孢屬（Exserohilum）、內(nèi)臍蠕孢屬（Drechslera）和長蠕孢屬（Helminthosporium）［8］。何偉等［4］報道了東北地區(qū)狗尾草和馬唐上的主要病原菌分別為狗尾草平臍蠕孢和新月彎孢，稗草上的主要病原菌是新月彎孢、麥根腐平臍蠕孢和尖角凸臍蠕孢。本研究從河南5種禾本科雜草上分離到的病原真菌中，每種雜草的主要病原菌都屬于平臍蠕孢屬或彎孢屬，凸臍蠕孢屬真菌僅分離到7株，這可能與不同地理區(qū)域、不同生態(tài)環(huán)境條件下真菌的種類不同有關(guān)，而莖點(diǎn)霉屬、鐮孢屬、黑孢屬、枝孢屬和炭疽菌屬真菌都僅分離到零星菌株。關(guān)于分離自禾本科雜草的具有生防潛力的蠕形分生孢子真菌已有多篇報道，如狗尾草上分離到的狗尾草長蠕孢（Helminthosporiumsetariae）［6］和狗尾草平臍蠕孢（B.setariae）［13］，馬唐上分離到的多節(jié)長蠕孢（H.nodulosa）和（Drechsleragigantea）［14－15］，牛筋草上分離到的多節(jié)長蠕孢（H.nodulosa）［16］，稗草上分離到的禾長蠕孢稗草?；停℉.gramineumf.sp.echinochloae）和早熟禾內(nèi)臍蠕孢（D.poae）［17－18］。作者等［13］的研究表明狗尾草平臍蠕孢（B.setariae）菌株NY1和新月彎孢（C.lunata）菌株zxl07289a對于禾本科雜草的生防潛力值得進(jìn)一步研究?？梢娙湫畏稚咦诱婢枪肺膊?、馬唐、稗草等常見禾本科雜草上的主要病原菌，是具有禾本科雜草生防潛力的真菌種類。

據(jù)報道95%以上的鏈格孢屬（Alternaria）真菌屬于兼性寄生菌［19］。有的對寄主具有很強(qiáng)的致病作用，如水葫蘆鏈格孢（A.eichchorniae）和百日草鏈格孢（A.zinniae）［20－21］；有的往往侵染植物的衰老和受傷部位，或迅速搶占其他病原菌侵染造成的植物枯死病斑，如鏈格孢（A.alternata）和細(xì)極鏈格孢（A.tenuissima）［19］。本研究中對于7株鏈格孢進(jìn)行了致病性測定，除1株A.alternata在4種供試禾本科雜草上均引起了明顯或較輕癥狀外，有5株均在1種供試禾本科雜草上產(chǎn)生了較輕癥狀。因此，可以推測本研究中分離到的鏈格孢菌株大部分都是禾本科雜草樣本上的病原真菌，不過其致病性一般較弱。

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