殼聚糖對(duì)青枯勞爾氏菌生長(zhǎng)及其生物膜形成的影響

蘇 婷， 王桂躍＊， 謝關(guān)林

（1.浙江省東陽(yáng)玉米研究所，東陽(yáng) 322100； 2.浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所，杭州 310029）

青枯勞爾氏菌［Ralstoniasolanacearum（Smith）Yabuuchi et al.］能引起系統(tǒng)侵染的毀滅性土傳病害，即作物青枯病。該病原的寄主范圍廣泛，可侵染44個(gè)科的數(shù)百種植物［1］。殼聚糖是由甲殼素經(jīng)脫乙酰化處理后的產(chǎn)物，具有良好的生物相容性，可生物降解且無(wú)毒副作用，廣泛存在于蝦、蟹等動(dòng)物外殼和藻類、真菌的細(xì)胞壁中［2－3］。殼聚糖是一種抗菌譜較廣的天然物質(zhì)，對(duì)細(xì)菌、真菌和病毒等均有不同程度的抑制作用。早在19世紀(jì)80年代末，Kendra［4］就發(fā)現(xiàn)殼聚糖對(duì)鐮刀菌等具有抑制效果，而經(jīng)殼聚糖溶液處理過的番茄植株能有效抑制Phytophthorainfestans菌絲的生長(zhǎng)，防止番茄早疫病的大面積發(fā)生［5］。殼聚糖種子處理后，辣椒幼苗能提高誘導(dǎo)抗性，預(yù)防Colletotrichumsp.的感染［6］。Li［7］等研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖能抑制Pseudomonasfluorescens，防止西蘭花頭腐病的發(fā)生。

細(xì)菌生物膜通常是附著在固體表面的微生物群體，其主要成分包括胞外多糖、胞外蛋白以及一些核酸［8］。生物膜的存在有助于細(xì)菌抵御不良的外界環(huán)境以及有害物質(zhì)的侵蝕，維持其生存環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定，這是細(xì)菌所具有的一種非常重要的環(huán)境適應(yīng)機(jī)制［9］。

本研究室已發(fā)現(xiàn)殼聚糖能有效防治番茄青枯病的發(fā)生，其土壤澆灌和種子處理后的防治效果分別達(dá)71.99%和48.01%［10］。本文通過檢測(cè)不同濃度的殼聚糖溶液在不同時(shí)間段對(duì)青枯菌的抑菌效果，了解殼聚糖對(duì)青枯菌生長(zhǎng)及其生物膜形成的影響，為殼聚糖控制植物青枯病提供更有利的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 殼聚糖的制備

將脫乙酰度為75%的殼聚糖粉末（購(gòu)自Sigma公司）溶解于體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸中，配制成濃度為10 mg／m L 的 殼 聚 糖 溶 液，調(diào) p H 至 5.6［3］，121℃滅菌20 min，待用。同時(shí)將p H為5.6，體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液滅菌待用。

1.2 青枯菌菌懸液的制備

試驗(yàn)所用青枯菌Rs－91菌株由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。挑取在TZC培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的青枯菌單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃，170 r／min振蕩培養(yǎng)24 h。

1.3 殼聚糖與菌懸液的混合培養(yǎng)

準(zhǔn)備6個(gè)已滅菌離心管，每管按表1加入混合培養(yǎng)物，使殼聚糖終濃度分別達(dá)0.00、0.05、0.10、0.15、0.20 mg／m L和0.25 mg／m L。各取100μL加入到96孔培養(yǎng)板中（為減少誤差，培養(yǎng)板的邊緣孔不加培養(yǎng)物），每處理設(shè)10個(gè)重復(fù)。

表1 殼聚糖與菌懸液的混合培養(yǎng)成分Table 1 Components for mixed culture of chitosan and bacterial suspension

1.4 殼聚糖抑菌效果的檢測(cè)

將1.3制備好的混合培養(yǎng)物在30℃條件下分別振蕩培養(yǎng)24、48 h和72 h。用排槍將每個(gè)孔內(nèi)的培養(yǎng)物混合均勻后，利用美國(guó)BIOTEK公司POW－ERWAVE XS全波長(zhǎng)掃描式酶標(biāo)儀測(cè)定在600 nm下的吸光值A(chǔ)600。抑菌率＝（對(duì)照組A600－試驗(yàn)組A600）／對(duì)照組A600。

1.5 生物膜形成的評(píng)價(jià)

應(yīng)用結(jié)晶紫的方法［11］對(duì)青枯菌在96孔培養(yǎng)板表面的成膜能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。將1.3制備好的混合培養(yǎng)物在30℃條件下分別靜置培養(yǎng)24、48 h和72 h，小心移去培養(yǎng)物后，用蒸餾水輕輕洗滌2次，然后加入100μL濃度為1%的結(jié)晶紫對(duì)殘留細(xì)胞和基質(zhì)進(jìn)行染色，25 min后用蒸餾水清洗2次，加入150μL二甲基亞砜以溶解吸附于生物膜上的結(jié)晶紫，測(cè)定其在570 nm下的吸光值，即A570。

1.6 透射電鏡觀察（TEM）

在1.96 m L濃度約為108cfu／m L的細(xì)菌懸浮液中加入0.04 m L濃度為10 mg／m L的殼聚糖溶液，使殼聚糖終濃度達(dá)0.2 mg／m L?；旌弦涸?8℃恒溫?fù)u床上170 r／min振蕩培養(yǎng)24 h，吸取1 m L混合液置于1.5 m L離心管中，4 000 g離心10 min。離心后的菌體在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定過夜。按照透射電鏡要求包埋處理后，在Reichert超薄切片機(jī)中切片，獲得70～90 nm的切片，該切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色15 min，即可在日本JEOL公司的JEM－1230型透射電鏡中觀察。同時(shí)設(shè)置無(wú)殼聚糖處理的菌懸液為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖對(duì)青枯菌生長(zhǎng)的抑制效果

結(jié)果顯示混合培養(yǎng)24 h后，當(dāng)殼聚糖終濃度在0.10 mg／mL和0.15 mg／mL時(shí)，兩者的A600和抑菌率存在顯著差異，而殼聚糖終濃度為0.15、0.20 mg／m L和0.25 mg／m L時(shí)，三者的A600和抑菌率在同一水平上（表2）。混合培養(yǎng)48 h和72 h后，當(dāng)殼聚糖終濃度超過0.15 mg／m L后，其對(duì)青枯菌的抑制效果處于同一水平。

混合培養(yǎng)48 h后，對(duì)照組的A600高達(dá)0.629，表明此時(shí)青枯菌生長(zhǎng)旺盛，但經(jīng)殼聚糖處理后，其抑菌率均高于相同殼聚糖濃度的其他時(shí)間段，最高抑菌率達(dá)74.3%。說明在生長(zhǎng)48 h時(shí)，青枯菌雖生長(zhǎng)旺盛，但對(duì)外界環(huán)境因素的作用敏感，殼聚糖對(duì)其抑制效果最顯著。

表2 殼聚糖對(duì)青枯菌生長(zhǎng)的抑制效果1）Table 2 Inhibitory effect of chitosan on the growth of Ralstonia solanacearum

2.2 殼聚糖對(duì)青枯菌生物膜形成的影響

結(jié)果顯示在培養(yǎng)24 h后，青枯菌生物膜形成能力較弱，殼聚糖對(duì)其未產(chǎn)生顯著影響，而對(duì)照組青枯菌生物膜形成量在培養(yǎng)48 h后達(dá)最大值，A570為0.202，隨著殼聚糖濃度的增加，青枯菌生物膜形成量越低，說明此時(shí)殼聚糖對(duì)其有一定的抑制作用（圖1）。但培養(yǎng)72 h后，青枯菌生物膜形成量反而降低，在無(wú)殼聚糖的條件下，其生物膜A570僅為0.151，而殼聚糖濃度的增加并未對(duì)青枯菌生物膜的形成量產(chǎn)生顯著影響。

2.3 殼聚糖處理青枯菌的透射電鏡觀察

未經(jīng)殼聚糖處理的青枯菌在電鏡下，細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞膜清晰，邊界明顯（圖2a）。殼聚糖處理24 h后，青枯菌的細(xì)胞膜出現(xiàn)破損，并且被一層帶狀的物質(zhì)所包裹，細(xì)胞質(zhì)膜逐漸與細(xì)胞外膜分離，在細(xì)胞內(nèi)部形成空泡，且細(xì)胞的形態(tài)變得不規(guī)則（圖2b）。

圖1 殼聚糖對(duì)青枯菌生物膜形成的影響Fig.1 Effect of chitosan on biofilm formation of R.solanacearum

圖2 青枯菌不處理對(duì)照（a）和0.2 mg／mL殼聚糖處理（b）在透射電鏡下的細(xì)胞形態(tài)Fig.2 Cellular morphology of R.solanacearum untreated（a，CK）and treated with 0.2 mg／m L chitosan（b）observed by transmission electron microscopy（TEM）

3 討論

大量研究表明，殼聚糖不僅能誘導(dǎo)植物增強(qiáng)自身防御反應(yīng)，產(chǎn)生廣譜抗性，還能直接作用于病原微生物而抑制多種植物病原菌的生長(zhǎng)［4－7］。而目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道多是用平板對(duì)峙法等檢測(cè)殼聚糖抑制植物病原細(xì)菌的生長(zhǎng)［10］，特別是菌落計(jì)數(shù)法可能存在較大誤差，而且操作繁瑣，不利于大批量樣本的檢測(cè)。本文用酶標(biāo)儀直接測(cè)定混合液體培養(yǎng)基的吸光值對(duì)青枯菌生長(zhǎng)情況進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示0.15 mg／m L的殼聚糖濃度能有效抑制青枯菌的生長(zhǎng)，而在培養(yǎng)48 h時(shí)，其抑菌率最高達(dá)74.3%。

青枯勞爾氏菌的主要致病因子是胞外蛋白和胞外多聚糖［12］，這些物質(zhì)正是生物膜的主要組成部分。而周智等［13］研究已發(fā)現(xiàn)在離體條件下殼聚糖處理后菌斑生物膜的形成能力受阻，可見殼聚糖對(duì)某些細(xì)菌的生物膜形成有抑制作用。作者檢測(cè)了不同濃度殼聚糖在不同時(shí)間段對(duì)青枯菌生物膜形成的影響，結(jié)果顯示隨著殼聚糖濃度的增加，青枯菌生物膜形成量有不同程度的降低，尤其在48 h時(shí)，其生物膜形成量逐漸降低，但未產(chǎn)生顯著差異。

殼聚糖能夠破壞一些細(xì)菌的外膜，如大腸桿菌、克雷柏氏桿菌、葡萄球菌等［14－15］，但對(duì)有些細(xì)菌膜的破壞并不劇烈［16］。通過殼聚糖處理青枯菌的透射電鏡觀察，我們認(rèn)為殼聚糖通過破壞青枯菌的細(xì)胞膜，改變細(xì)胞膜的通透性，引起細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的失常從而抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)。

殼聚糖作為一種良好的生物源農(nóng)藥，具有無(wú)毒、無(wú)污染和生物相容性等優(yōu)良特性，且在實(shí)際應(yīng)用中施用方式簡(jiǎn)單，使用安全，能和多種殺菌劑混合使用［2－3］，這些優(yōu)良特性決定了殼聚糖在防治植物病害方面將具有廣闊的應(yīng)用前景。但殼聚糖對(duì)植物病原菌抑菌反應(yīng)的機(jī)理十分復(fù)雜，隨著基因工程等技術(shù)的發(fā)展，相信殼聚糖的抑菌機(jī)理將愈來(lái)愈清楚。

［1］Guo J H，Qi H Y，Guo Y H，et al.Biocontrol of tomato wilt by plant growth－promoting rhizobacteria［J］.Biological Control，2004，29（1）：66－72.

［2］Chung Y C，Chen C Y.Antibacterial characteristics and activity of acid－soluble chitosan［J］.Bioresource Technology，2008，99（8）：2806－2814.

［3］Li B，Wang X，Chen R X，et al.Antibacterial activity of chitosan solution againstXanthomonaspathogenic bacteria isolated fromEuphorbiapulcherrima［J］.Carbohydrate Polymers，2008，72（2）：287－292.

［4］Kendra D F，Christian D，Hadwiger L A.Chitosan oligomers fromFusariumsolani／pea interactions，chitinase／β－glucanase digestion of sporelings and from fungal wall chitin actively inhibit fungal growth and enhance disease resistance［J］.Physiological and Molecular Plant Pathology，1989，35（3）：215－230.

［5］Atia M M M，Buchenauer H，Aly A Z，et al.Antifungal activity of chitosan againstPhytophthorainfestansand activation of defence mechanisms in tomato to late blight［J］.Biological Agriculture and Horticulture，2005，23（2）：175－197.

［6］Photchanachai S，Singkaew J，Thamthong J.Effects of chitosan seed treatment onColletotrichumsp.and seedling growth of chili cv.“Jinda”［J］.Acta Horticulturae，2006，712（2）：585－590.

［7］Li B，Liu B P，Su T，et al.Effect of chitosan solution on the inhibition ofPseudomonasfluorescenscausing bacterial head rot of broccoli［J］.The Plant Pathology Journal，2010，26（2）：189－193.

［8］Pratt L A，Kolter R.Genetic analyses of bacterial biofilm formation［J］.Current Opinion in Microbiology，1999，2（6）：598－603.

［9］Donlan R M.Biofilm formation：a clinically relevant microbiological process［J］.Clinical Infectious Diseases，2001，33（8）：1387－1392.

［10］Algam S A E，Xie G L，Li B，et al.Effects ofPaenibacillusstrains and chitosan on plant growth promotion and control ofRalstoniawilt in tomato［J］.Journal of Plant Pathology，2010，92（3）：593－600.

［11］Serio A W，Pechter K B，Sonenshein A L.Bacillussubtilisaconitase is required for efficient late－sporulation gene expression［J］.Journal of Bacteriology，2006，188（17）：6396－6405.

［12］王軍.青枯菌對(duì)植物的致病機(jī)制及其調(diào)節(jié)［J］.林業(yè)科學(xué)，2005，41（3）：142－147.

［13］周智，陳惠珍，胡德渝.殼寡聚糖對(duì)菌斑生物膜形成的影響［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，34（5）：978－980.

［14］Didenko L V，Gerasimenko D V，Konstantinova N D，et al.Ultrastructural study of chitosan effects onKlebsiellaandStaphylococci［J］.Bulletin of Experimental Biology and Medicine，2005，140（3）：356－360.

［15］Li X F，F(xiàn)eng X Q，Yang S，et al.Chitosan killsEscherichia colithrough damage to be of cell membrane mechanism［J］.Carbohydrate Polymers，2010，79（3）：493－499.

［16］Raafat D，von Bargen K，Haas A，et al.Insights into the mode of action of chitosan as an antibacterial compound［J］.Applied and Environmental Microbiology，2008，74（12）：3764－3773.