木霉REMI突變株主要生防酶活性改變及其基因部分序列差異的研究

劉 限， 孫淑清， 高增貴， 黃 哲

（1.沈陽農業(yè)大學生物科學技術學院，沈陽 110866；2.沈陽農業(yè)大學植物保護學院植物免疫研究所，沈陽 110866）

木霉具有快速生長、強產孢能力、分泌多種細胞壁降解酶（纖維素酶、幾丁質酶、葡聚糖酶等）和產生抗菌物質的能力。大多數木霉都具有很強的根際或葉圍競爭能力，能夠降解碳水化合物、酚復合物、多聚糖和在農業(yè)上廣泛使用的各種異質殺菌劑［1］。木霉的主要生防機制有重寄生［2］、抗菌物質［3］、營養(yǎng)競爭［4］和促進植物生長發(fā)育或誘導植物產生抗性［5］。與重寄生和營養(yǎng)競爭相關的酶主要包括NAGase、幾丁質酶、蛋白酶、β－1，3－葡聚糖酶、轉化酶和酯酶等，且不同木霉各種酶活性差異較大［6］，說明不同木霉在生防上發(fā)揮作用的機制是不同的。

限制性內切酶介導整合（restriction enzymemediated integration，REMI）技術可以用來轉化真菌［7］，從而隨機標記基因，并可通過PCR技術和質粒搶救等技術進行基因克隆和功能分析［8－9］，從而探索功能基因間的相互作用和基因表達差異的機理。已有研究表明，木霉REMI突變株對番茄灰霉病的防治效果存在差異，說明不同的菌株間生防活性存在差異［10］。因此本研究以木霉REMI突變株為研究對象，篩選出主要生防酶（幾丁質酶和葡聚糖酶）活性改變較大的菌株，研究幾丁質酶和葡聚糖酶生防酶活性的變化及其基因部分序列存在的差異，以期為闡明木霉生防活性改變的分子機制提供新思路和理論依據，也為利用轉基因技術提高木霉生防活性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：木霉菌株T21及其REMI突變株（Ttrm55、Ttrm68、Ttrm31、Ttrm94、Ttrm121、Ttrm123、Ttrm25、Ttrm76、Ttrm86），其中 REMI突變株是沈陽農業(yè)大學植物免疫研究所生物工程實驗室通過REMI技術構建并保存的。

1.2 木霉與番茄灰霉病菌的對峙培養(yǎng)

將番茄灰霉病菌菌片（6mm）接于PDA的平板邊緣，于28℃培養(yǎng)36h后再將轉化體和出發(fā)菌株T21對接于平板對面的邊緣，于28℃培養(yǎng)，并連續(xù)觀察菌落的生長情況，培養(yǎng)3d后，測量灰霉病菌菌餅到菌落邊緣的距離r。計算抑制率I（%）＝（R－r）／R（R為對照中未接木霉的灰霉病菌菌餅到菌落邊緣的距離）。

1.3 生防酶－幾丁質酶、β－1，3－葡聚糖酶活性測定

幾丁質酶活性測定參照顧向陽的方法，以每毫升反應混合物中每小時在37℃pH5.2條件下生成1μg N－乙酰葡糖胺為一個酶活單位U，比活性以每mg蛋白的酶活性單位表示（U／mg Protein）［11］。

β－1，3－葡聚糖酶活性測定參照高增貴的方法，以葡聚糖為底物，根據從葡聚糖中釋放出葡萄糖的量來測定酶活性［11］。

1.4 木霉不同REMI突變株與生防有關酶DNA序列間的差異

按照TRNzol試劑盒（天根）提供的方法提取木霉總RNA，檢測后按照TIANScript RT Kit試劑盒提供的方法進行RNA反轉錄獲得cDNA。然后根據GenBank中關于哈茨木霉幾丁質酶和β－1，3－葡聚糖酶的基因序列設計簡并引物，幾丁質酶（F：5′－AAGAAGCCAACCCACTTG－3′； R： 5′－GCATAGTCATAAGCCATCAGG－3′）和β－1，3－葡聚糖酶（F：5′－GCTCTTGCTCCTGGTGGTCGTTA－3′；R：5′－CAGGGTTGTTGCCAGCCATATT－3′），建 立20μL的PCR反應體系：cDNA模板1.5μL，上下游引物各1μL，2×Taq PCR Master－mix10μL，用ddH2O補足至20μL。PCR反應程序為：（1）95℃5min預變性，1個循環(huán)；（2）95 ℃ 20s變性，β－1，3－葡聚糖酶60℃25s退火（幾丁質酶54℃30s），68℃30s延伸，40循環(huán)；（3）68℃保溫5min，1循環(huán)；程序結束后進入4℃狀態(tài)。PCR產物經過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送大連寶生物公司測序。然后利用NCBI網站提供軟件進行BLAST比對分析。

2 結果與分析

2.1 木霉REMI突變株對番茄灰霉病菌的抑制作用

由圖1可知，不同木霉REMI株對番茄灰霉病菌的抑制作用有顯著差異，其中抑制作用最強的是菌株Ttrm68，抑制率高達70.6%；其次為Ttrm34、Ttrm31、Ttrm76、T21、Ttrm25、Ttrm55、Ttrm121、Ttrm86；而Ttrm94抑制效果最差，抑制率僅達到39.2%。采用新復極差法進行數據分析，在1%水平上，木霉REMI轉化體菌株與出發(fā)菌株T21的差異極顯著。另外，在對峙試驗中發(fā)現不同木霉REMI突變株對番茄灰霉病菌的作用方式也發(fā)生了變化，有的能夠覆蓋番茄灰霉病菌并在其上生長（如菌株Ttrm68、Ttrm76和Ttrm34），有的不能覆蓋番茄灰霉病菌（菌株 Ttrm25、Ttrm31、Ttrm55、Ttrm121和Ttrm86及出發(fā)菌株T21）。綜合分析試驗結果，篩選出Ttrm68、Ttrm25、Ttrm31、Ttrm94和 T21 5株對番茄灰霉病菌作用差異較大的木霉菌株，進一步研究其主要生防酶的活性。

圖1 轉化體菌株對番茄灰霉病的拮抗作用Fig.1 The antagonism of different Trichoderma strains to Botrytis cinerea

2.2 不同木霉REMI突變株幾丁質酶及β－1，3－葡聚糖酶的活性

5株木霉的幾丁質酶及β－1，3－葡聚糖酶活性測定結果見圖2。結果表明不同木霉REMI突變株產生的幾丁質酶的比活性不同。各木霉REMI突變株菌株間酶活性及與出發(fā)菌株T21間均存在極顯著差異。其中活性最高的為菌株Ttrm68，其次為菌株Ttrm31，菌株Ttrm94的活性最低。菌株Ttrm68及菌株Ttrm31幾丁質酶的活性均高于出發(fā)菌株T21，而菌株Ttrm25及菌株Ttrm94均低于出發(fā)菌株T21。由此可見不同木霉REMI突變株的幾丁質酶活性存在很大差異。不同木霉REMI突變株產生的β－1，3－葡聚糖酶的比活性不同，突變株Ttrm68活性最高，菌株Ttrm31的β－1，3－葡聚糖酶活性略低于Ttrm68，菌株Ttrm94的β－1，3－葡聚糖酶活性最低。由此可以看出通過對峙篩選出的不同木霉菌株間幾丁質酶和β－1，3－葡聚糖酶活性間存在差異，可以進一步進行其基因序列差異的分析。

圖2 木霉菌株幾丁質酶及β－1，3－葡聚糖酶活性Fig.2 β－1，3－glucanase activity and chitinase activity of different Trichodermastrains

2.3 木霉不同REMI突變株幾丁質酶和β－1，3－葡聚糖酶基因部分序列的差異比較

2.3.1 木霉菌株RNA的提取及幾丁質酶和β－1，3－葡聚糖酶基因PCR產物檢測

從圖3可以看出28S和18S條帶明亮、清晰，且28SrRNA亮度明顯高于18SrRNA亮度，是其亮度的兩倍多，說明RNA質量良好。以總RNA為模板反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板擴增出β－1，3－葡聚糖酶和內切幾丁質酶基因的部分片段，其中β－1，3－葡聚糖酶基因片段大小為448bp，內切幾丁質酶基因片段大小為374bp（圖4）。

2.3.2 木霉菌株幾丁質酶和β－1，3－葡聚糖酶基因部分序列比較

將獲得的幾丁質酶基因和β－1，3－葡聚糖酶基因的部分序列測序后，分別獲得有效序列為389個和280個堿基，利用Blast進行比對后發(fā)現，這5株不同木霉中，幾丁質酶基因中只有突變株Ttrm31和Ttrm68在限制性內切酶SalI的酶切位點處插入了GGTATCGATATCGAC片段（圖5），使其基因序列發(fā)生變化；其余2株與出發(fā)菌株T21的序列完全一致。

圖5 木霉幾丁質酶基因部分核酸序列Fig.5 Partial chitinase nucleotide sequences from different Trichodermastrains

由圖6可以看出，突變株Ttrm31和Ttrm68在限制性內切酶SalI的酶切位點后插入了GIDID（分別是甘氨酸，異亮氨酸，天冬氨酸，異亮氨酸和天冬氨酸）5個氨基酸，使得這兩個氨基酸序列發(fā)生變化。而突變株Ttrm25和Ttrm94的氨基酸序列與出發(fā)菌株T21的一致，沒發(fā)生任何變化。說明REMI部分插入影響到部分木霉幾丁質酶的基因，使其發(fā)生改變，進一步導致氨基酸序列發(fā)生改變。由于幾丁質酶活性測定結果顯示，突變株Ttrm25和Ttrm94幾丁質酶活性均低于出發(fā)菌株T21，推測可能由于插入到別的功能位點使其失效或減弱，從而造成酶活降低。突變株Ttrm68和Ttrm31酶活性均比出發(fā)菌株T21的高，所以推測插入處可能為其功能位點，增強了該酶的表達，該功能位點是一重要調控位點。

圖6 木霉幾丁質酶氨基酸部分序列Fig.6 Partial chitinase amino acid sequences fromTrichodermastrains

5株木霉菌β－1，3－葡聚糖酶基因經 RT－PCR擴增測序比較結果如圖7所示。突變株Ttrm94在限制性內切酶XhoI的酶切位點處插入了GTC；而菌株Ttrm25、Ttrm31、Ttrm68的基因序列與出發(fā)菌株T21一致，均未發(fā)生變化。

由圖8可以看出，Ttrm94在限制性內切酶XhoI的酶切位點后插入了R（精氨酸），精氨酸的側鏈帶有一個胍基，具有親水性，屬于功能基團，而功能基團對酶的活性起著重要的調節(jié)作用，從而可能改變了該菌株的β－1，3－葡聚糖酶的活性。

3 討論

由于限制性內切酶消化片段對染色體的插入是隨機的，一旦插入于有意義序列或調控序列，則該序列控制的一系列性狀將產生突變［13］。目前REMI技術主要應用于不同植物病原菌致病相關基因的研究［14－17］中，且有用于創(chuàng)造木霉菌株變異、篩選新生防菌株的報道［18］。本文在優(yōu)化哈茨木霉T21菌株原生質制備、再生、轉化條件的基礎［19］上，利用REMI技術將外源質粒DNA隨機插入到木霉的染色體中，從而使木霉中某些基因激活或者失活，篩選出主要生防酶活性不同的木霉REMI突變株，發(fā)現菌株間兩種生防酶的活性發(fā)生了極顯著的變化。幾丁質酶活性提高的Ttrm68和Ttrm31菌株的酶氨基酸序列中插入了GIDID 5個氨基酸殘基，在插入的氨基酸中甘氨酸的側鏈較小，在許多蛋白質構象中起著獨特作用；而天冬氨酸屬酸性氨基酸，含有β－羧基，帶負電，且經常出現在蛋白質分子表面，是構成酶的活性中心的氨基酸［19］。可能由于這些活性基團的加入，從而使酶活性升高。菌株Ttrm68的活性高于菌株Ttrm31可能由于在別的功能位點處同樣插入了能提高酶活的功能基團。β－1，3－葡聚糖酶活性降低的Ttrm94菌株其酶氨基酸序列中插入了R，可能由于精氨酸插入到β－1，3－葡聚糖酶的催化部位或結合部位，使其結構也發(fā)生變化，影響其與底物結合，也可能由于極性基團的影響改變其帶電狀態(tài)，使酶結合結構域或催化活性中心的電荷發(fā)生變化，從而使酶活性改變［20－21］。當然或許有其他位點也發(fā)生了改變造成酶活性改變，尚待進一步的深入研究。其他菌株間酶活性變化也可能是在別處插入后導致功能位點活性提高（或）降低，這些都需要進一步對這兩種酶的基因進行克隆，獲得全序列進行比對和分析，同時還需要對不同菌株產生的酶進行分離純化，研究其酶學性質來進一步探討其變化產生原因。

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