對(duì)甜菜夜蛾具有高毒力的Bt菌株篩選

郭 靖， 周子珊， 蔡吉林， 惠識(shí)瑤， 張 杰， 高繼國(guó)， 束長(zhǎng)龍＊

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

甜菜夜蛾［Spodoptera exigua（Hübner）］屬于鱗翅目夜蛾科，是一種間歇性暴發(fā)為害的農(nóng)業(yè)害蟲。隨著農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)改變和受全球氣候持續(xù)變暖因素的影響，其對(duì)蔬菜、棉花等經(jīng)濟(jì)作物造成嚴(yán)重的危害，并呈逐年上升趨勢(shì)［1］。由于化學(xué)殺蟲劑濫用而造成諸多負(fù)面影響，生物農(nóng)藥逐漸受到了全球的關(guān)注與重視［2］。

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt）自1938年產(chǎn)業(yè)化以來成功發(fā)展為目前全球應(yīng)用最廣的微生物殺蟲劑，在害蟲的防治中起到了越來越重要的作用［3－5］。目前國(guó)外商業(yè)化的Bt殺蟲劑主要有 Agree、Biobit、Condor、Cutlass、Dipel、Full－Bac、Javelin、Xentari等，這些產(chǎn)品所含有的晶體蛋白，主要是以B.thuringiensis subsp.kurstaki亞種（Btk）HD－1等菌株為主所產(chǎn)生的Cry1類或Cry2類蛋白［6］；其中對(duì)甜菜夜蛾有較好殺蟲活性的商業(yè)化殺蟲劑包括Agree和Xentari等。我國(guó)在防治夜蛾科害蟲的蘇云金芽胞桿菌研究和應(yīng)用方面也取得了一定成效，鄭大勝等從3 100株野生型Bt菌株中篩選到對(duì)甜菜夜蛾高毒菌株13株［7］。牛桂蘭［8］、金大勇［9］等分別篩選獲得了對(duì)甜菜夜蛾等害蟲高效的Bt菌株。但是，目前國(guó)內(nèi)用于防治甜菜夜蛾的Bt產(chǎn)品生產(chǎn)的菌株數(shù)量有限，其中武漢科諾公司的KN11菌株已經(jīng)成功產(chǎn)業(yè)化十余年。

作者從本實(shí)驗(yàn)室分離的Bt菌株中篩選對(duì)甜菜夜蛾具有高毒力的菌株，獲得了一株與生產(chǎn)菌株KN11毒力相當(dāng)?shù)木辏⑦M(jìn)行了殺蟲基因鑒定和毒素蛋白的分析，為新型Bt殺蟲基因分離克隆與制劑的開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株來源

陽性對(duì)照菌株KN11為武漢科諾生物科技股份有限公司惠贈(zèng)；G03菌株為實(shí)驗(yàn)室保存。

Bt分離株菌株為本實(shí)驗(yàn)室從國(guó)內(nèi)采集的土壤中分離獲得，完成了形態(tài)學(xué)觀察和初步的生物活性測(cè)定。

1.1.2 培養(yǎng)基

液體LB：1% 胰蛋白胨，0.5% 酵母提取物，1%NaCl，pH 7.0，15磅滅菌20min。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：3% 牛肉膏，5% 蛋白胨，pH 7.0，15磅滅菌20min。

1.1.3 試蟲人工飼料及試蟲來源

甜菜夜蛾試蟲飼料由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所棉花害蟲組提供；

甜菜夜蛾由武漢科諾生物科技股份有限公司提供。

1.1.4 生化試劑

引物由上海生工生物公司合成，Taq酶等PCR擴(kuò)增試劑購自TaKaRa公司，其他試劑均為市售國(guó)產(chǎn)或者進(jìn)口分析純或電泳級(jí)純?cè)噭?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

菌株篩選引物設(shè)計(jì)：通過文獻(xiàn)檢索，確定對(duì)夜蛾科害蟲具有高活性的cry基因有：cry2A、cry9、cry1B、cry1C［10］、vip3A［11］、cry1Ea［12］；分 別 將 這 6種基因進(jìn)行聚類分析，在保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，并對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的192株對(duì)鱗翅目具有高活性的Bt菌株進(jìn)行篩選。

采用PCR－RFLP的方法對(duì)cry1A 基因型進(jìn)行鑒定；鑒定方法參照文獻(xiàn)［13］。

幾丁質(zhì)酶基因鑒定引物設(shè)計(jì)：收集GenBank中Bt的幾丁質(zhì)酶序列，聚類分析后設(shè)計(jì)鑒定引物。cry基因特異性鑒定引物及幾丁質(zhì)酶基因鑒定引物見表1。

表1 PCR鑒定引物及其序列Table 1 PCR primer sequences

1.2.2 蘇云金芽胞桿菌質(zhì)粒圖譜分析

提取Bt菌株的大質(zhì)粒，并進(jìn)行電泳分析。大質(zhì)粒提取方法、電泳方法參見文獻(xiàn)［14］。

1.2.3 蘇云金芽胞桿菌晶體類型觀察

電鏡樣品制備：將Bt菌株在1／2LB平板上劃線培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)36h（約50%產(chǎn)生晶體）。收集菌體，滅菌水洗3次，12 000r／min離心10min收集芽胞和晶體的混合物。將沉淀懸浮在1mL滅菌水，混勻后，取少量菌液均勻涂于1cm2薄玻璃片上，晾干備用。

電鏡觀察：離子濺射噴金（2nm），掃描電鏡觀察。

1.2.4 蘇云金芽胞桿菌菌株晶體蛋白SDS－PAGE分析

Bt菌株菌粉SDS－PAGE分析方法：取0.1g菌體，1mol／L NaCl洗，滅菌水反復(fù)洗3次，取處理后的樣品100μL，加入25μL 0.5mol／L的NaOH，室溫反應(yīng)5min，加入5×Loading Buffer混勻，dd H2O補(bǔ)齊體系至200μL，100℃煮5min，12 000r／min離心5min，吸取上清液進(jìn)行加樣，進(jìn)行SDSPAGE分析；以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算菌粉的胞晶含量。

1.2.5 蛋白條帶的質(zhì)譜鑒定

SDS－PAGE電泳分析后，考馬斯亮藍(lán)R－250染色分析蛋白條帶，并小心切取所有蛋白條帶分裝于Ep管中，送往北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.2.6 蘇云金芽胞桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

菌種活化：接種蘇云金芽胞桿菌于5mL液體LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)。

生長(zhǎng)曲線測(cè)定：將過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到100mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中（1%的接菌量），30℃，220r／min條件下培養(yǎng)，每1h測(cè)定A600值，重復(fù)3次，繪制出菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.2.7 蘇云金芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶基因的檢測(cè)

以Bt菌株總DNA（實(shí)驗(yàn)室保存）為模板，kchi5和kchi3（表1）為鑒定引物，利用PCR的方法對(duì)Bt菌株幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行鑒定。

擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸，10min。

1.2.8 室內(nèi)殺蟲活性測(cè)定

樣品制備：挑取單菌落于5mL液體LB培養(yǎng)基中，30℃220r／min培養(yǎng)12h后，轉(zhuǎn)接于200mL液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中（1% 接菌量），30℃220r／min，培養(yǎng)至裂解產(chǎn)生晶體后（50% 以上），離心收集菌體，冷凍干燥－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

甜菜夜蛾生物活性測(cè)定：生測(cè)樣品準(zhǔn)備同上，放入24孔板后晾置，每孔接初孵齡幼蟲1頭，每個(gè)處理3次重復(fù)，25℃，培養(yǎng)7d后調(diào)查死、活蟲數(shù)，并觀察幼蟲取食情況，計(jì)算校正死亡率［15］。LC50值測(cè)定梯度設(shè)置（1.0mg／mL，按照3倍梯度稀釋，1／3倍，1／9倍，1／27倍，1／81倍，1／243倍）。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

采用POLO軟件計(jì)算LC50值［16］，待測(cè)樣品與陽性對(duì)照的LC50的比較采用成組法t檢驗(yàn)（Independent two samples t test），P＜0.05為差異顯著，所有統(tǒng)計(jì)分析在SPSS 16.0軟件中進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt菌株的cry基因篩選

利用所設(shè)計(jì)的特異性引物（表1）對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的192株對(duì)鱗翅目具有較高殺蟲活性的Bt菌株進(jìn)行篩選，得到15株基因型豐富的Bt菌株（表2）。

表2 分離菌株cry基因篩選表1）Table 2 Screening table for isolating crygene

2.2 Bt菌株的大質(zhì)粒圖譜分析

提取篩選的15株Bt菌株的大質(zhì)粒，電泳分析結(jié)果顯示：15株Bt菌株可分為8種類型。如圖1所示：其中 PS8－B2、PS4－C9、PS3－C5和 PS3－C2同屬于一種類型；PS1－G3、PS1－F3、PS1－G6、PS1－G7和 SCLB3同屬于一種類型，其余6種菌株各不相同。

圖1 Bt菌株質(zhì)粒圖譜分析Fig.1 Plasmid profile of Bt strain

2.3 Bt菌株晶體類型觀察

對(duì)8種類型的代表菌株進(jìn)行晶體類型觀察，這8株菌株中含有的晶體類型包括雙錐體形、球形、方形等（圖2）。

2.4 殺蟲晶體蛋白的SDS－PAGE分析

通過SDS－PAGE分析了8株Bt菌株所表達(dá)的Cry蛋白（圖3）。其中菌株P(guān)S1－F11和SCL－B3既表達(dá)130ku的蛋白又表達(dá)60ku左右的蛋白，PS8－B11同時(shí)表達(dá)130ku和70ku左右的蛋白，其余菌株均表達(dá)130ku左右的蛋白。

電泳圖片用ImageJ（v1.43）軟件進(jìn)行定量分析，各菌株發(fā)酵后的胞晶混合物中晶體蛋白含量定量分析結(jié)果見表3。

2.5 生物活性測(cè)定

菌株對(duì)甜菜夜蛾的初篩結(jié)果顯示：菌株P(guān)S3－C2和PS1－F11與陽性對(duì)照G03和KN11校正死亡率（1.0mg／mL和5.0mg／mL時(shí)）接近，因此選擇這兩株菌株進(jìn)行甜菜夜蛾致死中濃度的測(cè)定。

表3 菌株胞晶混合物殺蟲晶體蛋白含量Table 3 Contents of insecticidal proteins in bacterial cell crystal mixtures

表4 Bt菌株對(duì)甜菜夜蛾初孵幼蟲的生物活性初步測(cè)定Table 4 Preliminary bioassay of Bt strains against newly hatched larvae of S.exigua

根據(jù)菌株蛋白定量計(jì)算出的胞晶含量計(jì)算出晶體蛋白的致死中濃度。生物活性測(cè)定結(jié)果表明，菌株P(guān)S3－C2與KN11活性相當(dāng)，且與對(duì)照菌株KN11在P＜0.05水平上差異不顯著。

在菌株干粉水平上，菌株P(guān)S3－C2對(duì)甜菜夜蛾表現(xiàn)出很好的殺蟲活性；在計(jì)算為蛋白含量時(shí)菌株P(guān)S3－C2同樣表現(xiàn)出了很好的殺蟲活性，有的菌株雖然胞晶含量較高，但是，相比之下殺蟲活性并不高；所以綜合各因素，菌株P(guān)S3－C2具有比較好的應(yīng)用前景。

2.6 蘇云金芽胞桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

通過生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，對(duì)8株菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特性進(jìn)行比較，結(jié)果表明：在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，各菌株的生長(zhǎng)速度差別不大（圖4）。

表5 Bt菌株對(duì)甜菜夜蛾初孵幼蟲的生物活性測(cè)定Table 5 Bioassay of Bt strains against newly hatched larvae of S.exigua

圖4 菌株生長(zhǎng)速率比較（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）Fig.4 Growth rate of different Bt strains

2.7 蘇云金芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶基因及其活性檢測(cè)

利用鑒定引物（表1）對(duì)8株Bt菌株幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，電泳結(jié)果表明：這8株菌株在2 000bp左右均有明顯的擴(kuò)增條帶，且擴(kuò)增條帶大小為2 030bp（圖5），說明這8株菌株中均有幾丁質(zhì)酶基因的存在。

2.8 蛋白質(zhì)譜分析

根據(jù)生物活性數(shù)據(jù)結(jié)果顯示（見表5），菌株P(guān)S3－C2對(duì)甜菜夜蛾具有很好的殺蟲活性，通過SDSPAGE分析對(duì)這株菌株進(jìn)行了蛋白質(zhì)譜的分析，結(jié)果表明，菌株P(guān)S3－C2內(nèi)含有Cry1C蛋白。

圖5 菌株幾丁質(zhì)酶基因PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.5 PCR amplification of bacterial chitinase gene

表6 質(zhì)譜分析結(jié)果Table 6 Mass spectrum analysis

3 討論

Bt作為一種與環(huán)境友好的微生物殺蟲劑，具有巨大的應(yīng)用前景，在綠色植保中占有重要的地位［17－18］。本研究從192株對(duì)鱗翅目害蟲有活性的菌株中，篩選出3株對(duì)甜菜夜蛾具有較強(qiáng)毒殺作用的菌株，發(fā)現(xiàn)PS3－C2菌株與目前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)菌株KN11毒力相當(dāng)。同時(shí)進(jìn)行了晶體形態(tài)特征、SDS－PAGE、生長(zhǎng)曲線、幾丁質(zhì)酶和殺蟲蛋白基因鑒定等研究，這些結(jié)果為新的Bt基因分離克隆和殺蟲劑的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

Bt菌株的殺蟲活性高低與其所含有的殺蟲基因密切相關(guān)，經(jīng)過基因鑒定，本研究獲得的對(duì)甜菜夜蛾高毒力的菌株P(guān)S3－C2中含有對(duì)甜菜夜蛾高毒力的cry1C基因［19］，蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析結(jié)果證實(shí)該菌株能表達(dá)Cry1C蛋白，從分子水平證明了該菌株高毒力的成因。

本研究通過PCR的方法鑒定了菌株中的幾丁質(zhì)酶基因，發(fā)現(xiàn)8株菌株中均含有幾丁質(zhì)酶基因。據(jù)林毅等報(bào)道幾丁質(zhì)酶具有增強(qiáng)殺蟲晶體蛋白殺蟲效果的作用［20－21］，幾丁質(zhì)酶在Bt殺蟲作用中扮演著重要角色，重視這個(gè)毒力因子的作用，將為新一代Bt產(chǎn)品的研發(fā)提供更多的選擇。

以往評(píng)價(jià)Bt菌株殺蟲效果多以發(fā)酵液和干粉直接進(jìn)行計(jì)算。而不同菌株的生物學(xué)特性差異很大，其發(fā)酵液和干粉中殺蟲晶體蛋白的含量差異更大，僅以發(fā)酵液的倍數(shù)或干粉的質(zhì)量來計(jì)算生測(cè)數(shù)據(jù)，菌株之間的可比性不大。本研究采用NaOH溶解方法對(duì)發(fā)酵干粉中殺蟲晶體蛋白進(jìn)行定量，測(cè)算出晶體蛋白的LC50，這種方法上的改進(jìn)能夠更加準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)菌株的殺蟲活性，篩選出真正高毒力的菌株。

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