胸腺法新微乳的制備及質(zhì)量評定

李元元，徐風(fēng)華（解放軍總醫(yī)院藥品保障中心制劑室，北京 100853）

近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，蛋白多肽類藥物在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛，其共同的特點是分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且分子量大，脂溶性差，很難通過生物膜屏障，通常為靜脈或肌內(nèi)注射給藥，基本劑型是凍干粉注射劑[1]，給臨床用藥帶來不便，尤其是需要長期用藥的患者。因此，該類藥物的非注射途徑給藥新劑型的研究成為熱點，通常采用的制劑技術(shù)包括化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾、微乳技術(shù)、微球技術(shù)、脂質(zhì)體技術(shù)等[2]。其中，微乳是研究應(yīng)用較多的新型藥物載體，它是由油相、表面活性劑、助表面活性劑和水相按一定比例自發(fā)形成的透明或半透明的液體制劑，是黏度低、各向同性、且粒徑在10 ～ 100 nm的熱力學(xué)穩(wěn)定的溶液體系[3]，可以分為三種類型：油包水型微乳（W/O）、水包油型微乳（O/W）、雙連續(xù)型微乳。

胸腺法新（thymalfasin）是由28個氨基酸組成的酸性多肽，是一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，生物學(xué)活性較為廣泛，臨床用于治療乙肝、丙肝、腫瘤和艾滋病，也可作為疫苗輔助藥物，治療效果顯著[4]。但由于胸腺法新分子量較大，不易通過生物屏障，生物半衰期短（＜ 2 h），且口服易被胃腸道中的蛋白質(zhì)水解酶降解,生物利用度不高[5]。本實驗應(yīng)用微乳技術(shù)制備胸腺法新W/O型微乳，主要對其處方篩選、制備工藝及其理化性質(zhì)和穩(wěn)定性進(jìn)行考察，為研發(fā)胸腺法新的新劑型提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Adveturer AR2140電子分析天平（奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司）；S-7四聯(lián)磁力攪拌器（北京北德科技有限公司）；NDJ-5S旋轉(zhuǎn)粘度計（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；WZS-1阿貝折光儀（上海光學(xué)儀器六廠）；H-7650電子透視電鏡（日本日立公司）；Nano-ZS90激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）。

胸腺法新（含量100.8%，成都圣諾生物制藥有限公司，批號：THSA100201）；無水乙醇（分析純，北京化工廠，批號：20100408）；異丙醇（分析純，北京化工廠，批號：20100506）；Span80（湖南爾康制藥有限公司，批號：20091202）；Tween80（Fisher scientific worldwide company，批號：G3665F7015682F）；辛癸酸三甘油酯（GTCC，上海千為油脂科技有限公司)；十四酸異丙酯（IPM，力德士（北京）化學(xué)技術(shù)有限公司）；氫氧化鈉（分析純，北京化學(xué)試劑中心）；磷酸二氫鉀（分析純，北京化學(xué)試劑中心）；蘇丹紅Ⅲ（美國Sigma公司）；亞甲基藍(lán)（北京中生瑞泰科技有限公司）；重蒸水（自制）。

1.2 空白微乳處方的篩選

本實驗采用單因素篩選獲得最佳微乳處方?？疾靸?nèi)容包括表面活性劑（Span80、Span80和Tween80復(fù)配）、助表面活性劑（乙醇、異丙醇、無助表面活性劑）、Span80/Tween80比例（1∶2，1∶1和2∶1）、油相（GTCC、IPM）及水相（蒸餾水、PBS緩沖液）。

水相和混合表面活性劑以不同比例制備微乳，采用滴定法繪制偽三元相圖。具體方法為：將一定比例的表面活性劑與助表面活性劑混合均勻后，再將該混合液與油相分別按一定的質(zhì)量比（1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2，9∶1）混合均勻；然后向混合液滴加水相并不停的攪拌使體系充分混勻，當(dāng)體系由澄清變混濁時為臨界點，記錄臨界點時加入水相的質(zhì)量。按油相、混合表面活性劑、水相在所得體系的各自質(zhì)量百分比繪制偽三元相圖，確定其微乳區(qū)域。

1.3 胸腺法新微乳的制備

按照最佳處方將油相、混合表面活性劑攪拌均勻得混合液約2.89 g，備用。精密稱定胸腺法新5 mg溶于定量的水相中，然后將胸腺法新水溶液加入到上述混合液中，攪拌至澄清透明，即得。

1.4 胸腺法新微乳的鑒別

1.4.1 電導(dǎo)法 采用電導(dǎo)率儀分別測定水、IPM、微乳的電導(dǎo)率值。

1.4.2 染色法 取兩份等體積的胸腺法新微乳，分別將蘇丹紅Ⅲ和亞甲基藍(lán)粉末加入到微乳中，靜置一段時間觀察兩種染色的擴(kuò)散速度。

1.4.3 稀釋法 將微乳分別滴于油相和水相中，觀察其在油相和水相中是否散開。

1.4.4 折光率 利用阿貝折光率儀，測定微乳的折光

1.4.5 黏度 利用旋轉(zhuǎn)式黏度計測定微乳的黏度。

1.4.6 粒徑的測定 采用馬爾文激光粒度儀測定微乳的粒徑。

1.4.7 形態(tài)學(xué)考察 滴1滴乳液于覆有Formvar膜的銅網(wǎng)上，自然晾干后用透射電鏡觀察乳液的形態(tài)。

1.5 胸腺法新微乳的含量測定

采用HPLC法測定胸腺法新微乳中的胸腺法新含量，色譜條件為：色譜柱：Venusil XBP C18柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm）；流動相：磷酸鹽緩沖液（pH =5.7）-乙腈（92∶8）為流動相A，乙腈為流動相B，采用梯度洗脫：在0 ～ 30 min內(nèi)流動相B的比例從0升至16%，31 min時降為0；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：20 μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=15 837X+ 2.763 6（r= 1.000 0，n= 6）；線性范圍為0.01 ～0.1 mg·mL-1，精密度RSD為0.10%，回收率98.99%，RSD為0.12%。按處方分別制備3批樣品，測定其含量標(biāo)示量，含量標(biāo)示量=測得量/加入量×100%。

1.6 胸腺法新微乳的穩(wěn)定性考察

制備三批胸腺法新微乳置于西林瓶中密封，在常溫下放置3個月，分別于0、1、2、3月取樣，考察其外觀、離心后是否分層（5000 r·min-1，離心10 min）、pH值等理化指標(biāo)，并測定微乳中藥物含量。

2 結(jié)果

2.1 微乳處方的篩選及優(yōu)化

2.1.1 表面活性劑的選擇 分別對Span80和Span80/Tween80按比例（1∶2，1∶1和2∶1）復(fù)配兩種試劑進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，單獨應(yīng)用Span80制備的微乳面積極小，黏度大；而Span80/Tween80復(fù)配體系制備的微乳流動性好，且穩(wěn)定。因此，選擇Span80/Tween80復(fù)配的表面活性劑。

2.1.2 助表面活性劑對微乳形成的影響 以GTCC為油相，Span80/Tween80為表面活性劑，助表面活性劑分別采用乙醇、異丙醇和無助表面活性劑三種，結(jié)果顯示，三個三元相圖有明顯區(qū)別，無助表面活性劑的微乳區(qū)域面積最大，如圖1所示，因此，選擇處方中不加入助表面活性劑。

圖1 GTCC/Span80-Tween80/助表面活性劑/蒸餾水，不同助表面活性劑的偽三元相圖Fig 1 Pseudo-ternary phase diagrams of GTCC/Span80-Tween80/different cosurfacant/water

2.1.3 Span80/Tween80不同比例對微乳形成的影響 以GTCC為油相，Span80/Tween80比例分別為1∶2、1∶1和2∶1時制備胸腺法新微乳，繪制三元相圖，所得結(jié)果如圖2所示。微乳區(qū)域面積隨Span80/Tween80比例值增大而逐漸減小，因此，選用Span80/Tween80 = 1∶2的體系。

圖2 GTCC/Span80-Tween80/蒸餾水，不同Span80/Tween80比例的三元相圖Fig 2 Ternary phase diagrams of GTCC/Span80-Tween80 with different ratio/water

2.1.4 油相對微乳形成的影響 分別選用GTCC、IPM作為油相考察其對微乳形成的影響。如圖3所示，可以看出2種油相均能形成微乳，但以IPM為油相形成的微乳區(qū)域面積較大（表面活性劑為Span80/Tween80按1∶2混合），故選擇IPM為油相。

圖3 油相/Span80-Tween80/蒸餾水，不同的油相的三元相圖Fig 3 Ternary phase diagrams of different Oil/Span80-Tween80/water

以IPM為油相，對上述表面活性劑、助表面活性劑及按Span80/Tween80比例再進(jìn)行篩選驗證，所得結(jié)果相同，即以Span80/Tween80按比例為1∶2混合作為表面活性劑，不加助表面活性劑為優(yōu)化條件制備微乳。

2.1.5 水相的選擇 水相分別選用PBS緩沖液和蒸餾水，繪制三元相圖，由圖4可知，微乳載水量相差不大?；谛叵俜ㄐ侣匀苡赑BS緩沖液而微溶于水的考慮，水相選用PBS緩沖液（pH = 6.8）。

圖4 IPM/Span80-Tween80/水相，不同水相的三元相圖Fig 4 Ternary phase diagrams of IPM /Span80-Tween80/different water phase

結(jié)合胸腺法新的性質(zhì)和微乳的載水量，最終確定最佳的處方配比為IPM∶Span80∶Tween80∶PBS =38.2∶17.4∶34.8∶9.6。

2.2 胸腺法新微乳的鑒定及質(zhì)量評價

胸腺法新微乳為透明的淡黃色溶液，流動性好；電導(dǎo)法測得電導(dǎo)率值為0.58 μs·cm-1，接近于油相電導(dǎo)率值；分別加入蘇丹紅Ⅲ和亞甲基藍(lán)粉末（蘇丹紅Ⅲ為油性染料，亞甲基藍(lán)為水性染料），紅色的擴(kuò)散速度大于藍(lán)色的擴(kuò)散速度；乳液能夠被其外相所稀釋，微乳滴入油相時立即散開，而滴入水相時則不能。以上實驗均證明該微乳體系外相為油相，為W/O型微乳。

胸腺法新微乳的折光率為1.448 2，黏度為32 mpa·s；通過透射電鏡觀察，胸腺法新微乳為粒徑大小不均的球形，如圖5所示；利用英國馬爾文激光粒度儀測得粒徑分布為10 ～ 30 nm，平均粒徑26.68 nm，見圖6。

按處方量制備的三批胸腺法新微乳樣品，HPLC法測定含量標(biāo)示量為97.59%、96.67%、95.74%。

圖5 胸腺法新微乳的透射電鏡觀察Fig 5 The observation of thymalfasin microemulsion under TEM

圖6 胸腺法新微乳的粒徑分布Fig 6 The size distribution of thymalfasin microemulsion

2.3 胸腺法新微乳的穩(wěn)定性

胸腺法新微乳在室溫條件下分別放置1、2、3個月，其外觀均為透明的淡黃色溶液，pH值沒有明顯變化，未見油水相分離，離心后亦未見分層。微乳中胸腺法新含量無明顯變化。

3 討論

3.1 表面活性劑和助表面活性劑的篩選

由于制備微乳時需加入表面活性劑的量比較大，為減少微乳的體內(nèi)毒性，本實驗選用低毒的非離子表面活性劑Span80和Tween80，結(jié)果表明復(fù)配的表面活性劑（Span80/Tween80）比單獨應(yīng)用Span80的效果好，與文獻(xiàn)[6]報道的表面活性劑復(fù)配，既可以增加協(xié)同性，又可以使體系穩(wěn)定是一致的。另外，雖然助表面活性劑可能使微乳的流動性增強，但載水量并沒有增大，因此，我們采用了不加入助表面活性劑的處方，這同時也可減少微乳在體內(nèi)的刺激性。

3.2 胸腺法新新劑型研究

近年來，有將胸腺法新制成結(jié)腸片[7]、緩釋微球[8]的報道，但國內(nèi)外文獻(xiàn)未見將其制成微乳。本實驗利用微乳能夠促進(jìn)藥物吸收，避免其不被蛋白酶水解的優(yōu)勢將胸腺法新制備成微乳制劑。通過理化性質(zhì)及穩(wěn)定性考察，證明胸腺法新微乳體系為穩(wěn)定的W/O型微乳，且制備工藝簡單，質(zhì)量可控。該微乳體系在體內(nèi)非注射途徑給藥是否能提高胸腺法新的生物利用度我們將進(jìn)一步進(jìn)行研究證實。

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