DNA條形碼在媒介蚊類鑒定中的應(yīng)用

方義亮，高 博，王宇平，肖 武，張建慶，王光輝，凌飛躍

蚊類是動(dòng)物界昆蟲綱雙翅目的重要組成成員，其形態(tài)多樣，種類繁多，目前全世界已知共有40屬3 500多種（亞種）［1］，在我國就有21屬387多種（亞種）［2］，與人類關(guān)系密切，其中中華按蚊、雷氏按蚊（曾名為嗜人按蚊）［3］、大劣按蚊、微小按蚊、淡色庫蚊、致倦庫蚊、三帶喙庫蚊、白紋伊蚊、埃及伊蚊、騷擾阿蚊等除了可騷擾刺吸外，還可傳播瘧疾、絲蟲病、流行性乙型腦炎、登革熱／登革出血熱、黃熱病、西尼羅熱、基孔肯亞熱等80多種疾病。因?yàn)槊浇槲妙惖尼t(yī)學(xué)重要性，對(duì)其鑒定與識(shí)別成為監(jiān)測(cè)與控制疾病發(fā)生與傳播的基礎(chǔ)，同時(shí)也是疾病預(yù)防與控制、國境衛(wèi)生檢疫的核心環(huán)節(jié)。本文就蚊類形態(tài)鑒定方法、DNA條形碼技術(shù)及其在蚊類鑒定上的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期對(duì)蚊傳疾病的預(yù)防和控制、衛(wèi)生檢疫有所幫助。

1 傳統(tǒng)媒介生物鑒定方法

目前口岸媒介生物的傳統(tǒng)鑒定方法為形態(tài)學(xué)鑒定方法，主要是依靠有形態(tài)學(xué)鑒定經(jīng)驗(yàn)、具有媒介生物形態(tài)鑒定知識(shí)的實(shí)驗(yàn)室專業(yè)人員根據(jù)醫(yī)學(xué)媒介分類檢索表進(jìn)行種類鑒定。整個(gè)鑒定過程大致需要數(shù)周的時(shí)間，對(duì)于截獲的卵、幼蟲和蛹，由于鑒定特征細(xì)微難辨，往往需要培養(yǎng)至成蟲再鑒定，如果是少見的國外種類，還要請(qǐng)國外專家協(xié)助鑒定，鑒定所需的時(shí)間就更多了。例如2009年福建出入境檢驗(yàn)檢疫局在菲律賓入境的船舶“美達(dá)108”上先后截獲兩批埃及伊蚊幼蟲，從截獲到飼養(yǎng)至成蚊整個(gè)過程需10d。

受限于鑒定人員的經(jīng)驗(yàn)積累、專業(yè)要求、標(biāo)本完整性與發(fā)育階段，傳統(tǒng)媒介蚊種鑒定方法存在著鑒定專家數(shù)量有限、鑒定周期長、鑒定效率低等問題。口岸有害生物媒介檢疫除了進(jìn)一步提高檢疫人員鑒定能力，研制開發(fā)鑒定輔助系統(tǒng)（如醫(yī)學(xué)媒介生物遠(yuǎn)程鑒定系統(tǒng)）外，仍需要發(fā)展各種安全、快速、準(zhǔn)確、靈敏、高通量的檢疫鑒定技術(shù)體系，以達(dá)到快速鑒定、風(fēng)險(xiǎn)分析、及時(shí)預(yù)警、有效控制的目標(biāo)。

2 新型媒介蚊類鑒定方法的形成

新型媒介生物鑒定方法是有別于形態(tài)學(xué)鑒定方法，不受限于形態(tài)表型特征，而是以媒介生物核酸堿基排列順序?yàn)榛A(chǔ)的數(shù)字化鑒定方法。新型媒介蚊類鑒定方法是伴隨著蚊蟲分類學(xué)發(fā)展而發(fā)展的。1758年，瑞典自然學(xué)者林奈用雙名法命名尖音庫蚊，標(biāo)識(shí)著以外部形態(tài)為依據(jù)的蚊類傳統(tǒng)分類體系的建立。由于蚊蟲分類系統(tǒng)中存在大量的復(fù)合組（體）、種團(tuán)和近緣種，蚊蟲分類學(xué)發(fā)展陷入困境。20世紀(jì)50年代細(xì)胞遺傳方法的引入，澄清了五斑按蚊復(fù)合組（Anopeles muculipennis Complex）、岡比亞按蚊復(fù)合組（An．gombiae Complex）和赫坎按蚊種團(tuán)（An．hyrcanus Group）等近緣種分類問題，使蚊蟲分類進(jìn)入了細(xì)胞水平。由于取材技術(shù)方面的困難，細(xì)胞遺傳技術(shù)使用范圍受限，到20世紀(jì)60－70年代，蚊蟲分類引入酶譜學(xué)技術(shù)，并且應(yīng)用遺傳距離概念描述同工酶等位基因頻率的變化，蚊蟲分類學(xué)進(jìn)入蛋白質(zhì)分子水平，蚊蟲分子分類學(xué)初步形成。之后氣相色譜分析技術(shù)、重組DNA技術(shù)也應(yīng)用到蚊蟲分子分類中來。近20年來，隨著分子生物學(xué)新技術(shù)如RAPD、PCR－SSCP和AFLP等的發(fā)展，多種分子標(biāo)識(shí)如微衛(wèi)星、線粒體基因（COⅠ、COⅡ等）和核糖體基因（ITS）的引入，蚊蟲分子鑒定技術(shù)獲得突飛猛進(jìn)的發(fā)展［4－6］，至此，為新型的蚊類鑒定技術(shù)出現(xiàn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，一種別于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定技術(shù)，基于機(jī)體的核酸堿基排列順序的鑒定技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

3 DNA條形碼

條形碼（barcoding）多見于日常生活中的商品上，由規(guī)則排列的條、空符號(hào)和數(shù)字表示每一件商品的信息，節(jié)省識(shí)別商品信息的時(shí)間，提高銷售效率。同樣的道理，DNA條形碼技術(shù)指的是通過特定DNA片段的核酸序列代表特定生物信息，達(dá)到識(shí)別生物的目的。該概念是在分子生物學(xué)和信息技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)上，由加拿大生物學(xué)家 Hebert［7］首先提出，因其有不受發(fā)育階段影響、不受個(gè)體形態(tài)特征影響、不受物種的限制、可以鑒定出群體中的隱存分類單元、獲取信息量大、精確性高、操作簡便且高效等優(yōu)點(diǎn)使得DNA條形碼技術(shù)受到分類鑒定工作者的普遍歡迎，并迅速發(fā)展成為學(xué)科前沿之一［8］。

DNA條形碼是標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的特定DNA片段，其選擇標(biāo)準(zhǔn)一般為［9］：1、片段盡量短，一般不超過700bp，兩端包含保守區(qū)域，能為通用引物所擴(kuò)增。2、具有足夠的變異信息區(qū)分不同的物種。不同的物種和不同的研究需要所選擇的DNA條形碼不同，不同物種的識(shí)別有時(shí)需要不同DNA條形碼。鑒于此目前運(yùn)用于媒介蚊類的DNA條形碼主要有核糖體基因rDNA片段（ITS、IGS、5．8s，28s、18s）、線粒體基因 mtDNA片段（COI、COII、ND4、ND5、Ctyb、控制區(qū)D）。

4 DNA條形碼在蚊媒鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育的應(yīng)用

核糖體基因（rDNA）由rRNA的重復(fù)串聯(lián)單位組成，每一單位5′－3′包含如下幾個(gè)區(qū)段：1）非轉(zhuǎn)錄區(qū)NTS；2）外轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ETS；3）18SrDNA；4）內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1ITS1；5）5．8SrDNA；6）內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2ITS2；7）28SrDNA。ITS序列分別位于18SrDNA和28SrDNA之間，被5．8SrDNA分成兩個(gè)部分（ITS1、ITS2），而這幾部分組成了一個(gè)重復(fù)單位。兩個(gè)重復(fù)單位間隔區(qū)為IGS。在基因組中屬于高度重復(fù)序列，而且通過不等交換和基因轉(zhuǎn)換，這些重復(fù)單位間可發(fā)生位點(diǎn)內(nèi)或位點(diǎn)間的同步進(jìn)化（concerted evolution），這就為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序奠定了理論基礎(chǔ)［10］。而由于rDNA的保守區(qū)域較多，便于引物設(shè)計(jì)，同時(shí)不同區(qū)域進(jìn)化水平不同，可用于不同分類等級(jí)的研究，所以基于rDNA的條形碼技術(shù)廣泛應(yīng)用于昆蟲系統(tǒng)發(fā)育與區(qū)系研究［11］。

ITS1、ITS2 分別位于18S－5．8SrDNA、5．8S－28SrDNA之間，而18S、5．8S、28SrDNA 序列非常保守，有利于引物的設(shè)計(jì)，可用與它們序列互補(bǔ)的通用引物對(duì)ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序，另外ITS變異速度較快，能夠提供較豐富的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)，所以ITS適合作為DNA條形碼的目的DNA片段。基于rDNA－ITS2條形碼技術(shù)進(jìn)行種團(tuán)、復(fù)合體之間進(jìn)行鑒定，在發(fā)現(xiàn)隱種和種團(tuán)內(nèi)鑒定起到了重要的作用。史慧勤等［12］，對(duì)云南、海南、廣西以及泰國4個(gè)不同地區(qū)7個(gè)不同地理株微小按蚊rDNA－ITS2條形碼進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)微小按蚊存在A、C兩型（373～375bp，GC%＝55．76～56．03%），替換11處、顛換13處，缺失／插入2處，地理株內(nèi)個(gè)體間rDNA－ITS2序列的差異很小或無。與近緣種相比，微小按蚊ITS2片段的GC含量與Van Bortel等［13］和 Manonmai等［14］研究發(fā)現(xiàn)的按蚊（55．56%）、瓦容按蚊（54．56%）、溪流按蚊（54．96%～55．50%）相接近。馬雅軍等［15］利用rDNA－ITS2對(duì)我國多斑按蚊復(fù)合體5成員種經(jīng)PCR后進(jìn)行鑒別，偽威氏按蚊（328bp、GC 58．54%、多 斑 按 蚊 （330bp、GC 57．85%），威氏按蚊（337bp、GC 59．05%），達(dá)羅毗按蚊（334bp、GC 58．68%），塞沃按蚊（338bp、GC 57．69%），各種內(nèi)的ITS2序列保守，而種間的差異率范圍為9．7%～18．9% 。同期馬雅軍等［16］又對(duì)赫坎按蚊種團(tuán)成員進(jìn)行鑒定，ITS2片段468～436 bp，GC% ＝44．9% ～46．8%，種 內(nèi) 差 異 0% ～3．8%，種間差異9．0%～32．3%，種內(nèi)差異小于種間差異。rDNA－ITS2條形碼在蚊媒種內(nèi)變異很小，而種間差異較大，適合作為近緣種的識(shí)別與鑒定。

表1 核酸序列各區(qū)域應(yīng)用范圍［11］Tab．1 Application regional scope of nucleic acid sequence

線粒體DNA（mtDNA）廣泛存在于昆蟲體內(nèi)，其大小一般約為15．4～16．3kb，封閉環(huán)狀雙鏈，其中含有編碼2個(gè)核糖體RNA（12SrRNA，16SrRNA）、22個(gè)tRNA、線粒體內(nèi)膜蛋白質(zhì)多聚體的12個(gè)亞基（3個(gè)細(xì)胞素氧化酶COI、COII、COIII，1個(gè)細(xì)胞色素b，6個(gè)NADH講解酶ND1～6和2個(gè)ATP酶6和8），核酸序列和組成較保守，以其作為模板制作的PCR反應(yīng)引物的通用性比較強(qiáng)。同時(shí)，mtDNA基因組不含間隔區(qū)和內(nèi)含子，無重復(fù)序列不等交換，在遺傳過程中不發(fā)生基因重組、倒位、易位等突變，嚴(yán)格遵守母系遺傳的方式。由于有這些結(jié)構(gòu)和進(jìn)化上的特點(diǎn)，基于mtDNA條形碼技術(shù)在國外逐漸被運(yùn)用于蚊蟲物種鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的研究［17－20］，國內(nèi)也有不少的學(xué)者關(guān)注。王冬等［21］應(yīng)用mtDNA－COI條形碼特征闡明我國大劣按蚊A、D群體的遺傳差異和分化水平。李石柱等［22］等測(cè)定并比較分析多斑按蚊復(fù)合體5成員種mtDNACOⅡ條形碼（684bp，GC 24．85%～26．02%），顯示種內(nèi)差異0．15%～0．58%，種間差異較大（3．66%～9．63%）。宋社吾等［23］通過測(cè)定我國尖音庫蚊復(fù)合組4亞種、三帶喙庫蚊、白紋伊蚊和中華按蚊mtDNA－16srRNA條碼，發(fā)現(xiàn)尖音庫蚊復(fù)合組4亞種 mtDNA－16srRNA條碼基本一致（554bp，GC 25．41%），不同種間存在差異，與三帶喙庫蚊0．54%、與白紋伊蚊5．77%，與中華按蚊9．62%，表明 mtDNA－16srRNA條碼種內(nèi)十分保守，難以反映亞種階元，但可以用于種間鑒別。

5 DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)

目前，DNA條形碼已成為生物分類和鑒定的新方向，是生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)展最迅速的學(xué)科前沿之一，在物種鑒定方面具有廣闊的應(yīng)用前景。我們的世界擁有數(shù)量龐大、種類繁多的動(dòng)植物，而每一個(gè)物種都是極其珍貴的資源。大量的事實(shí)證明，DNA條形碼技術(shù)是一個(gè)方便高效的物種鑒定方法，不但是傳統(tǒng)生物鑒定強(qiáng)有力的補(bǔ)充，而且由于其融入了數(shù)字化手段，使樣品在鑒定過程中實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化，突破了傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)的束縛。DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展方向主要有微型DNA條形碼鑒定技術(shù)和DNA條形碼芯片技術(shù)。

5．1 微型DNA條形碼鑒定技術(shù) 微型DNA條形碼技術(shù)是基于DNA條形碼技術(shù)發(fā)展起來的新方法，其要求的基因序列堿基長度比DNA條形碼要求更短，一般為100～150bp［24－25］，有效地解決了陳舊標(biāo)本因核酸片段不容易提取而造成鑒定困難的難題。目前已經(jīng)應(yīng)用到魚類［26］、蛤蚧［27］、實(shí)蠅［28］等物種鑒定上。

5．2 DNA條形碼芯片技術(shù) DNA芯片技術(shù)的原理是雜交測(cè)序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測(cè)定的方法，以此來準(zhǔn)確鑒定物種。由于該技術(shù)能夠同時(shí)將大量探針固定于支持物上，可以實(shí)現(xiàn)一次性對(duì)樣品大量序列進(jìn)行檢測(cè)和分析，具有操作簡便、自動(dòng)化程度高、操作序列數(shù)量多、檢測(cè)效率高等優(yōu)勢(shì)，目前在檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域已開始有所探索［29－31］。

6 結(jié) 語

DNA條形碼技術(shù)作為新興的技術(shù)，是傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的重要補(bǔ)充，其發(fā)展和成熟有賴于條形碼技術(shù)的規(guī)范和統(tǒng)一，另外更重要的是需要條形碼庫的進(jìn)一步完善和補(bǔ)充，而這中間將有一段很長的路需要繼續(xù)探索。

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