家蠅幼蟲抗菌肽對幽門螺桿菌抗菌作用分析

黃 健，莫 非

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H．pylori，）是定植于胃黏膜表面的常見致病菌，與胃炎、消化性潰瘍、胃癌、胃 MALT淋巴瘤的發(fā)生密切有關(guān)［1－3］，有效根除H．pylori成為大家關(guān)注的焦點。然而H．pylori對抗生素日趨耐藥［4］，研發(fā)新型抗 H．pylori藥物成為臨床治療的迫切需求。

昆蟲特有的免疫系統(tǒng)能夠?qū)θ肭煮w內(nèi)的病原體及異物產(chǎn)生明顯的免疫防御反應(yīng)。不同的外源物質(zhì)，都能在昆蟲血淋巴中檢測到相應(yīng)的抗菌肽（antibacterial peptides）［5］。其具有不易產(chǎn) 生耐藥，作為天然藥物對人體的毒副作用較小等獨特優(yōu)勢，因此以抗菌肽為基礎(chǔ)的新型抗菌藥物研制顯現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

家蠅（Musca domestica）生長在病菌叢生的環(huán)境中，具有繁殖能力強，容易養(yǎng)殖等特點，其免疫防御機制引起研究者的關(guān)注。但目前主要集中在抗大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌以及真菌的研究［6－9］，未見其對 H．pylori抑菌作用相關(guān)報道。本課題組前期以H．pylori針刺誘導(dǎo)和分離純化家蠅3齡幼蟲的抗菌肽為研究對象，運用十二烷基硫酸鈉 － 聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）技術(shù)與雙向凝膠電泳技術(shù)（two－dimensional electrophoresis，2－DE）檢測其對 H．pylori作用前后的蛋白質(zhì)表達水平的影響，初步研究家蠅抗菌肽對H．pylori的抑菌機制。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 家蠅幼蟲與菌株 家蠅由本實驗室飼養(yǎng)傳代，幼蟲按照常規(guī)飼養(yǎng)至3齡（孵化后第5d）養(yǎng)蠅房恒溫25℃，光周期12L∶12D，H．pylori國際標準測序株ATCC 700392，購自美國菌種保藏中心（ATCC），由本實驗室保存。

1．1．2 主要試劑 哥倫比亞血瓊脂粉購于Oxoid公司；萬古霉素、兩性霉素、多粘菌素B、TMP購于Sigma公司；IPG pH 3－10NL 干膠條、IPG buffer、DTT、尿 素、硫 脲、TCA、AP、SDS、IAA、Tris、CHAPS購于Amersham Biosciences公司；甘氨酸、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺購于Amresco公司；蛋白定量試劑盒購于Biomiga公司。

1．2 方法

1．2．1 家蠅的免疫誘導(dǎo) H．pylori微需氧培養(yǎng)48h后測OD600＝0．5時終止培養(yǎng)，采用生理鹽水清洗菌體，3 000r／min，4 ℃離心10min后，棄上清，再次加入1／2菌沉淀體積的生理鹽水懸浮沉淀，作為誘導(dǎo)源，用蘸取誘導(dǎo)源的昆蟲針針刺家蠅2d齡幼蟲，然后將其放入培養(yǎng)皿內(nèi)，繼續(xù)飼養(yǎng)48h。

1．2．2 家蠅幼蟲抗菌肽的制備

1．2．2．1 家蠅幼蟲提取物的制備 采用瞬時破壁法［8］制備家蠅3d齡幼蟲提取物，即取30g新鮮家蠅3d齡幼蟲洗凈和體表消毒后勻漿后迅速在4℃、12 000r／min條件下離心30min，提取上清液沸水浴10min，再次4 ℃、12 000r／min離心10min取上清備用。

1．2．2．2 分離純化家蠅幼蟲抗菌肽 依次采用固相萃取、反相高效液相色譜（RP－HPLC）方法從家蠅幼蟲血淋巴中分離純化得到抗菌肽，具體操作按照文獻制備［10］。

1．2．2．3 家蠅幼蟲抗菌肽的蛋白濃度測定 采用BCA蛋白濃度測定法進行測定。取10μL家蠅幼蟲抗菌肽和6種不同濃度的蛋白質(zhì)標準溶液加入2 mL的BCA工作液，在480nm波長處測定其吸收值，計算出家蠅幼蟲抗菌肽的蛋白濃度。

1．2．3 抗菌肽對細菌生長曲線影響 取對數(shù)生長期H．pylori加入到適量的液體培養(yǎng)基（腦心浸液肉湯，含10%小牛血清，1%混合抗生素）中配制成濃度為3．0×105CFU／mL的菌懸液，再加入抗菌肽液，使其終濃度達到40μg／mL，輕微塞上棉塞，設(shè)為實驗組。37℃三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)（5%O2、10%CO2、85%N2，相對濕度95%以上 ）。每隔12h取樣測OD600值，繪出抗菌肽作用后細菌的生長曲線，設(shè)正常H．pylori作為對照組。

1．2．4 SDS－PAGE觀察抗菌肽對 H．pylori蛋白質(zhì)影響 在抗菌肽終濃度為40μg／mL平板上培養(yǎng)至48h后的 H．pylori ATCC 700392設(shè)為實驗組，同批未經(jīng)抗菌肽處理的 H．pylori ATCC 700392為對照組。分別取實驗組和對照組的H．pylori菌液，用 PBS（pH7．4）洗滌，6 000r／min，4℃離心5min，收集10μg沉淀，用50μL 1×SDS上樣緩沖液重懸菌體，進行SDS－PAGE電泳。

1．2．5 雙向電泳觀察抗菌肽對H．pylori全菌蛋白的影響

1．2．5．1 H．pylori全菌蛋白的制備 在抗菌肽終濃度為40μg／mL平板上培養(yǎng)至48h后的H．pylori ATCC 700392設(shè)為實驗組，同批未經(jīng)抗菌肽處理的H．pylori ATCC 700392為對照組。分別取實驗組和對照組的H．pylori菌液，用PBS（pH7．4）洗滌，6 000r／min，4℃離心5min，取沉淀后，分別加入5mL 0．2%二硫蘇糖醇（DTT）、20%三氯乙酸（TCA）丙酮溶液，置－20 ℃冷凍過夜；6 000r／min、4℃離心，10min，去上清后加入5mL 0．2%DTT丙酮溶液，12 000r／min、4℃離心，10min，沉淀物重懸于5mL 0．2%DTT丙酮中，－20℃冷凍4h，12 000r／min、4℃離心，10min，將沉淀物－80℃ 預(yù)凍4h，真空冷凍干燥，超聲波促溶。5 000r／min、4℃離心10min，取上清分裝，置－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．5．2 等電聚焦（IEF） ①加樣：在加樣器中分別加入800μg蛋白樣品，IPG buffer 2．25μL，水化液補足至450μL，各加樣器中分別加入1．6mL覆蓋油。②IEF：把加樣器平行放于等電聚焦電泳儀上，采用低電壓溶脹，85 805v／h，共計25．5h。③ 平衡：IEF結(jié)束后，分別取10mL平衡儲存液2份，各加入100mg DTT和480mg TCA，將干膠條浸入其中，依次振蕩平衡15min。

1．2．5．3 SDS－PAGE電泳 將平衡后的干膠條轉(zhuǎn)至12．5%聚丙烯酰胺凝膠上，加0．5%低熔點瓊脂糖封好，電泳至溴酚藍離下界面約5mm處時停止電泳?？捡R斯亮藍染色用于制備型凝膠顯色。

1．2．5．4 差異蛋白點質(zhì)譜鑒定 用 Amersham Bioscience的掃描儀透射掃描，光學(xué)分辨率為500dpi，對比度與亮度采用軟件默認值?？既灸z掃描后用保鮮膜包裹，4℃保存以便取點時使用。數(shù)字化圖像文件運用Image Master 2DElite軟件分析。

1．2．5．5 質(zhì)譜鑒定 按照ABI 4700型基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜操作指南進行。

1．2．5．6 蛋白質(zhì)系列數(shù)據(jù)庫檢索 利用 Mascot搜索引擎等將 MALDI－TOF－TOF／MS所測各蛋白點質(zhì)量指紋譜數(shù)據(jù)在Inter－net上搜索 NCBInr數(shù)據(jù)庫，種屬設(shè)定為“Bateria”和“Mamma－lian”。

2 結(jié) 果

2．1 抗菌肽對幽門螺桿菌生長曲線的影響 圖1所示，對照組生長良好，在48h活菌濃度達到108以上，持續(xù)生長，完成了生長的對數(shù)期，穩(wěn)定期，并逐步進入衰亡期。而實驗組H．pylori不能達到正常的生長高峰進入對數(shù)生長期，在48h后直接進入衰亡期。2．2 SDS－PAGE結(jié)果 在實驗組與對照組同時進行培養(yǎng)48h后，如圖2所示，實驗組較對照組共有3條蛋白條帶發(fā)生顯著的變化，在分子量約66．4kDa有兩條蛋白條帶較對照組顏色淺，而分子量約40 kDa的有一條蛋白條帶較對照組顏色深，提示家蠅幼蟲抗菌肽作用后H．pylori菌體蛋白表達量發(fā)生變化。

圖1 正常幽門螺桿菌的生長曲線與抗菌肽作用后幽門螺桿菌的生長曲線的比較Fig．1 Comparison between normal H．pylori growth curve and H．pylori growth curve with the effect of antimicrobial peptides

圖2 H．pylori全菌蛋白SDS－PAGE圖譜Fig．2 SDS－PAGE chart of H．pylori total bacterial protein 1：The H．pylori total bacterial protein of the experimental group；2：The H．pylori total bacterial protein of the control group；3：Protein marker．

2．3 2－DE的平行性分析 將同組在相同上樣量、兩次電泳的2－DE圖像上的點進行檢測和匹配，結(jié)果顯示兩次2－DE的平行性較好，其匹配率達95%以上。結(jié)果見表1。

表1 同組間的匹配率的比較Tab．1 Comparison of matching rate in the same group

2．4 對照組和實驗組H．pylori菌株間差異蛋白的分析 實驗組和對照組均分離到960多個蛋白點，其中5個點在存在明顯的差異，詳見圖3，4。經(jīng)上海博苑科技有限公司ABI 4700質(zhì)譜儀分析，共鑒定出5個差異蛋白，分別為脯氨酸肽酶（Proline peptidase）（圖4a－1，圖4a－2）；過氧化氫酶（catalase）（圖4b－1，圖4b－2）；S－腺苷甲硫氨酸合成酶（S－adenosylmethionine synthetase）（圖4c－1，圖4c－2）；尿素酶 B（ureB）（圖4d－1，圖4d－2）；50S核糖體蛋白L1（50Sribosomal protein L1）（圖e－1，圖e－2）。

圖3 實驗組和對照組H．pylori菌株2－DE電泳圖Fig．3 The 2－DE electrophoretogram of H．pylori bacterial strain in the experimental group and the control group A：Experimental group；B：Control group

圖4 H．pylori蛋白差異點局部放大圖譜Fig．4 Local enlarged chart of H．pylori protein spotsa1and a2：Proline peptidase of the control group and the experimental group respectively；b1and b2：Catalase of the control group and the experimental group respectively；c1and c2：S－adenosylmethionine synthetase of the control group and the experimental group respectively；d1and d2：The ure B of the control group and the experimental group respectively；e1and e2：The 50Sribosomal protein L1of the control group and the experimental group respectively．

3 討 論

H．pylori呈螺旋形或是S形，是微需氧革蘭陰性菌。目前普遍采用國際標準三聯(lián)療法對H．pylori感染進行治療。該療法的副作用大，同時容易產(chǎn)生H．pylori的耐藥株，為進一步治療增加難度。此外還有很多的不良反應(yīng)。因此，從天然資源中尋找抗H．pylori的新型藥物，有望為H．pylori的抗感染治療開辟一條新的途徑。

本研究結(jié)果表明，H．pylori在40μg／mL家蠅抗菌肽作用下不能進入生長對數(shù)期，很快進入了衰亡期，推測非致死量的家蠅幼蟲抗菌肽作用后的H．pylori分裂雖然被抑制但生長并未終止，細菌進入非分裂狀態(tài)，表明其已通過某種途徑作用于細菌的某個或幾個關(guān)鍵系統(tǒng)，改變了細菌的正常生理功能狀態(tài)，從而抑制了細菌的生長。

我們在實驗初期對現(xiàn)有的2－DE系統(tǒng)在分離H．pylori的全菌蛋白方面進行了評價，顯示本實驗的2－DE系統(tǒng)具有良好的重復(fù)性，實驗所選的對照為自身對照，充分發(fā)揮了2－DE的優(yōu)勢，這為尋找家蠅幼蟲抗菌肽作用H．pylori前后差異表達蛋白提供了基礎(chǔ)。本研究選用亞抑菌濃度1／2MIC作為家蠅幼蟲抗菌肽研究濃度，即在40μg／mL藥物作用下的H．pylori為實驗組，同批生長的未經(jīng)抗菌肽作用的H．pylori為對照組，發(fā)現(xiàn)5個具有差異的蛋白點，這5個差異蛋白點以H．pylori能夠在體內(nèi)定植和體外存活密切相關(guān)［11－12］。分子量在40kDa左右的S－腺苷甲硫氨酸合成酶，50S核糖體蛋白表達量較對照組上調(diào)，在分子量60kDa左右的過氧化氫酶，脯氨酸肽酶、尿素酶B（ureB）蛋白表達量較對照組下調(diào)，這與SDS－PAGE結(jié)果一致。因此推測家蠅幼蟲抗菌肽作用于H．pylori后，通過影響H．pylori的抗氧化系統(tǒng)、能量代謝系統(tǒng)以及參與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白使細菌的生長代謝受到顯著的影響，同時干擾其在機體內(nèi)的定植密度和降低減弱H．pylori在體外的生存能力，從而起到抗H．pylori的功效。

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