薯莨中鞣質(zhì)類成分的含量測(cè)定△

王小平，陳建章，王進(jìn)

(江西中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，江西 撫州 344000)

薯莨中鞣質(zhì)類成分的含量測(cè)定△

王小平*，陳建章，王進(jìn)

(江西中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，江西 撫州 344000)

目的：測(cè)定黎川巖泉自然保護(hù)區(qū)中薯莨的總鞣質(zhì)和縮合鞣質(zhì)含量。方法：采用《中國(guó)藥典》(2010年版)比色法測(cè)定總鞣質(zhì)，采用香草醛硫酸法測(cè)定縮合鞣質(zhì)。結(jié)果：薯莨中總鞣質(zhì)與縮合鞣質(zhì)平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(501.81±8.62)mg·g-1，(421.78±11.65)mg·g-1。結(jié)論：薯莨鞣質(zhì)含量高，鞣質(zhì)類型主要為縮合鞣質(zhì)，具有良好的開發(fā)前景。

薯莨；總鞣質(zhì)；縮合鞣質(zhì)；比色法；香草醛硫酸法

婦科經(jīng)、帶、胎、產(chǎn)、雜等病的出血證為臨床常見病，是導(dǎo)致婦女慢性貧血、繼發(fā)性感染和不孕不育癥的重要原因，而采取有效的藥物治療對(duì)出血病癥有著積極的作用。目前臨床可用的止血藥品種雖然較多，鑒于婦科出血與內(nèi)分泌功能等多種因素有關(guān)，單純應(yīng)用化學(xué)止血藥并不能止住其出血狀況，且往往易多發(fā)，副作用多。因此，選用具有多靶點(diǎn)、多成分、多環(huán)節(jié)作用特點(diǎn)的中藥制劑治療婦科出血病癥存在著巨大的市場(chǎng)需求。薯莨為薯蕷科植物薯莨DiascoreocirrhosaLour.的塊莖。味甘、酸，性平；有小毒。具有補(bǔ)血活血，收斂止血，通絡(luò)止痛的功能。在民間，薯莨有悠久的應(yīng)用歷史，其止血作用突出，廣泛用于治療內(nèi)傷吐血、外傷出血、痢疾、失血性貧血、月經(jīng)過多、血崩等癥。薯莨中主要含鞣質(zhì)、酚類、苷類、蛋白質(zhì)、糖類、黏液等成分，其中生物活性成分為縮合鞣質(zhì)[1-2]。目前，尚無同時(shí)測(cè)定薯莨中主要生物活性成分總鞣質(zhì)與縮合鞣質(zhì)的文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)分別采用《中國(guó)藥典》2010年版一部磷鉬鎢酸比色法及香草醛硫酸法測(cè)定其總鞣質(zhì)及縮合鞣質(zhì)含量，為薯莨質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Tu-1901型紫外可見分光光度計(jì)(北京普析)；METTLER-TOLEDD AB265-S型電子分析天平(瑞士梅特勒)；KQ3200超聲波清洗器(中國(guó)昆山)；FST-Ⅲ-10精密型超純水機(jī)(上海富詩特)。

1.2 材料

薯莨采集于江西省黎川縣巖泉自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)我校李秀英副教授鑒定為薯蕷科植物薯莨DiascoreocirrhosaLour.；沒食子酸對(duì)照品(批號(hào)：110831-200302)、兒茶素對(duì)照品(批號(hào)：110877-200001)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；干酪素(上海精細(xì)化工科技有限公司，批號(hào)：20091011)；化學(xué)試劑均為分析純。

磷鉬鎢酸試劑：依《中國(guó)藥典》2010版一部附錄ⅩⅤB項(xiàng)下方法配制。

2 方法

2.1 總鞣質(zhì)含量測(cè)定[3]

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對(duì)照品51.36 mg，置100 mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。精密量取5 mL，置50 mL棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對(duì)照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置于25 mL棕色容量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試劑1 mL，再分別加水11.5，11，10，9，8，7 mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法，在760 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=0.074 8X-0.034 7，r=0.999 8，表明沒食子酸濃度在1.03～10.27 μg·mL-1與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.1.3 供試品溶液的制備 取薯莨粉末約0.25 g，精密稱定，置250 mL棕色容量瓶中，加水150 mL，放置過夜，超聲處理25 min，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液20 mL，置100 mL棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 精密度考察 取供試品溶液適量，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下方法，連續(xù)測(cè)定吸光度6次。結(jié)果吸光度RSD=0.01%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性考察 稱取薯莨粉末0.25 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下方法，每隔20 min測(cè)定1次吸光度，測(cè)定時(shí)間為2 h。結(jié)果吸光度RSD=2.63%，表明供試品溶液在2 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 分別稱取同一批次薯莨粉末6份，每份0.25 g，精密稱定，依法制備供試品溶液并測(cè)定總酚量與不被吸附的多酚量。結(jié)果總鞣質(zhì)平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為494.37 mg·g-1，RSD=2.64%，表明樣品測(cè)定方法重復(fù)性好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 分別稱取已知總酚含量的薯莨粉末6份，每份0.1 g，精密稱定，各加入精密稱定的沒食子酸對(duì)照品10 mg，依法制備供試品溶液并測(cè)定總酚量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 薯莨中沒食子酸加樣回收率試驗(yàn)

2.1.8 含量測(cè)定

2.1.8.1 總酚 精密量取供試品溶液2 mL，置25 mL棕色容量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下，自“加入磷鉬鎢酸試液1 mL”起同法操作，加水10 mL，測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的濃度，計(jì)算即得。

2.1.8.2 不被吸附的多酚 精密量取供試品溶液25 mL，加至已盛有干酪素0.6 g的100 mL具塞錐形瓶中，密塞，置30 ℃水浴中保溫1 h，時(shí)時(shí)振搖，取出放冷，搖勻，濾過，棄去初濾液，續(xù)濾液備用。另稱取干酪素0.6 g，置100 mL具塞錐形瓶，加水25 mL，密塞，同法隨行制備干酪素空白溶液。精密量取續(xù)濾液各2 mL，分別置于25 mL棕色容量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1 mL”開始，加水10 mL，測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的濃度，按公式計(jì)算不被吸附的多酚量，不被吸附的多酚量=溶液中游離多酚的含量-干酪素空白溶液中多酚的含量。

按公式計(jì)算總鞣質(zhì)含量：鞣質(zhì)含量=總酚量-不被吸附的多酚量

2.2 縮合鞣質(zhì)含量測(cè)定[4]

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取兒茶素對(duì)照品16.71 mg，置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得兒茶素貯備液。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取兒茶素貯備液0.5，1，2，3，4，5 mL，分別置于10 mL量瓶中，加入甲醇稀釋定容至刻度，搖勻。精密量取各溶液0.5 mL，分別加至包有錫箔的試管中，加入2.5 mL 3%香草醛甲醇溶液和2.5 mL 30%濃硫酸甲醇溶液，搖勻，避光顯色20 min。以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=0.029 9X-0.039，r=0.999 3，表明兒茶素濃度在3.0～30.4 μg·mL-1與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.2.3 供試品溶液的制備 取薯莨粉末約0.1 g，精密稱定，置50 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，超聲處理30 min，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液適量，依法連續(xù)測(cè)定6 次，結(jié)果吸光度RSD=0.10%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取薯莨粉末0.1 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下方法，分別于第0，10，20，30，40，50，60 min測(cè)定吸光度，結(jié)果吸光度RSD=1.09%，表明樣品溶液在1 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 分別稱取同一批次薯莨粉末6份，每份0.1 g，精密稱定，依法制備供試品溶液并測(cè)定吸光度，計(jì)算縮合鞣質(zhì)平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為418.63 mg·g-1，RSD=2.52%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 分別稱取已知縮合鞣質(zhì)含量的薯莨粉末6份，每份0.06 g，精密稱定，各加入濃度為1.128 mg·mL-1兒茶素對(duì)照品溶液4 mL，依法制備供試品溶液并測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 薯莨中兒茶素加樣回收率試驗(yàn)

注：兒茶素對(duì)照品加入量均為4.512 mg

2.2.8 含量測(cè)定 精密量取供試品溶液0.5 mL，置包有錫箔的試管中，分別加入2.5 mL 3%香草醛甲醇溶液和2.5 mL 30%濃硫酸甲醇溶液，搖勻，避光顯色20 min，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中兒茶素的濃度，計(jì)算即得。

2.3 含量測(cè)定結(jié)果

分別稱取薯莨藥材粉末3批，依法測(cè)定其中總鞣質(zhì)與縮合鞣質(zhì)含量，結(jié)果見表3。

表3 薯莨中總鞣質(zhì)與縮合鞣質(zhì)含量測(cè)定 /mg·g-1

3 討論

鞣質(zhì)是一類廣泛存在于植物中比較復(fù)雜的具有沉淀蛋白質(zhì)性質(zhì)的水溶性多元酚類化合物，具有廣泛的藥理作用。薯莨中主要活性指標(biāo)成分為鞣質(zhì)，具有抗菌、抗?jié)?、抗病毒、抗菌、止血及降壓等作用[5-6]。根據(jù)薯莨中所含鞣質(zhì)類成分性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)采用《中國(guó)藥典》比色法及香草醛硫酸法分別測(cè)定其中總鞣質(zhì)與縮合鞣質(zhì)含量，結(jié)果表明采自黎川巖泉自然保護(hù)區(qū)內(nèi)的野生薯莨中主要含縮合鞣質(zhì)，開發(fā)前景良好。

采用《中國(guó)藥典》法測(cè)定鞣質(zhì)過程中，干酪素可能會(huì)干擾試驗(yàn)結(jié)果。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明與文獻(xiàn)報(bào)道[7]一致。因此，本文在測(cè)定不被吸附的多酚含量時(shí)，隨行干酪素空白試驗(yàn)。

采用《中國(guó)藥典》2010年版附錄ⅩB鞣質(zhì)測(cè)定法測(cè)定鞣質(zhì)時(shí)，需加入29%碳酸鈉溶液。由于碳酸鈉溶解度受溫度影響，在室溫較低的冬季進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，碳酸鈉較易析出晶體而影響測(cè)定，而在氣溫較高的夏天進(jìn)行本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)時(shí)，測(cè)定方法的可操作性良好。因此，采用本法測(cè)定鞣質(zhì)時(shí)是否應(yīng)加高濃度的碳酸鈉溶液值得商榷。

[1] 南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典[M].第二版.下冊(cè).上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：3722.

[2] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草[M].第22卷.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999：228.

[3] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄62.

[4] 程悅，陳嘉升，陳建萍，等.地榆提取物中不同類型鞣質(zhì)的測(cè)定[J].中成藥，2011，33(5)：852-857.

[5] 鐘超，嚴(yán)奉祥.薯莨的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2007，23(5)：675-677.

[6] 夏承來，鐘超.薯莨醇提成分對(duì)大鼠血壓的影響[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30(1)：160-162.

[7] 謝道剛，宋光志，劉靜.鞣質(zhì)含量測(cè)定法(2005版藥典一部附錄ⅩB)方法學(xué)驗(yàn)證[J].世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2006，8(6)：50-53.

DeterminationofTanninsContentinDioscoreacirrhosaLour.

WANG Xiao-ping*, CHEN Jian-zhang, WANG Jin

(JiangxiCollegeofTraditionalChineseMedicine，F(xiàn)uzhou344000,China)

Objective：To establish the quantitative assay of total tannins and condensed tannins inDioscoreacirrhosaLour. from the Lichuan Yanquan Nature Reserve of Jiangxi province.Methods: The colorimetry in Chinese Pharmacopoeia(2010)was used for the determination of total tannins content.The Vanillin-H2SO4method was employed for the determination of condensed tannins content.Results: The content of total tannins and condensed tannins were (501.81±8.62) mg·g-1and (421.78±11.65) mg·g-1respectively.Conclusion: WildDioscoreacirrhosaLour.collected from the Lichuan Yanquan Nature Reserve of Jiangxi province，contained high content tannins which was mainly condensed tannin. This impliesDioscoreacirrhosaLour. has a good exploration prospect.

DioscoreacirrhosaLour.；Total tannins；Condensed tannin；Colorimetry；Vanillin-H2SO4method

2012-09-01)

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江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研基金重點(diǎn)課題(2009Z11)

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王小平，Tel：(0794)8239328，E-mail：jxrcwxp@163.com