丹參注射液對(duì)急性腦梗死大鼠腦組織VEGF表達(dá)的影響1）

趙 寧，陸 琳，楊萬章，林 慧，王碧涵

急性腦梗死（ACI）往往導(dǎo)致患者運(yùn)動(dòng)、感覺、語言、認(rèn)知、吞咽及精神情感障礙。神經(jīng)系統(tǒng)及腦血管損傷后，神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)會(huì)發(fā)生改變，這些改變與血管及神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性之間有重要關(guān)系。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）作為血管發(fā)生的神經(jīng)營養(yǎng)因子，是促進(jìn)血管新生、重建微循環(huán)所必須，亦同樣具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)再生作用［1］。本研究用具有活血化瘀作用的丹參注射液腹腔注射，從改善ACI后微環(huán)境著手，觀察與血管神經(jīng)重塑密切相關(guān)的VEGF表達(dá)和神經(jīng)功能缺損評(píng)分的變化，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康成年雄性SD大鼠60只（廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），8周齡，體重250g～300g。飼養(yǎng)于正常晝夜環(huán)境中，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料及飲水。

1．2 腦梗死大鼠模型的制備 大鼠麻醉固定。鈍性分離胸骨舌骨肌、胸骨鎖骨肌、肩胛舌骨肌。鏡下分離暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈的分支翼腭動(dòng)脈（PPA）。電凝ECA的分支－枕動(dòng)脈、甲狀腺上動(dòng)脈、咽升動(dòng)脈、上頜外動(dòng)脈，結(jié)扎并游離ECA的主干。在ECA殘端剪一0．2mm的小口，將線栓插入，為防止尼龍線滑出和出血，將頸外動(dòng)脈的備用絲線系緊 ，然后松開ICA和CCA處的活結(jié)。拉動(dòng)ECA殘端，使ECA與ICA成一條直線，將線栓向ICA插入，待線拴頭端通過ICA與PPA分叉處后，松開PPA處的活結(jié)。繼續(xù)將線栓插入大腦前動(dòng)脈近端，此時(shí)線栓插入深度為（18．5±0．5）mm，并在ICA與PPA分叉處扎緊ICA，分層縫合皮膚。把大鼠放在復(fù)蘇盒內(nèi)，待大鼠清醒后單獨(dú)飼養(yǎng)，自由攝取水和食物。

1．3 入選標(biāo)準(zhǔn) 大鼠手術(shù)后12h根據(jù)Zeal Longa的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分，1分～3分大鼠入選，成功模型選入實(shí)驗(yàn)研究。

1．4 分組及給藥 入選大鼠先按給藥的方式分為3組：A、B及C組。A組：丹參注射液組；B組：對(duì)照組；C組：假手術(shù)組，每組12只。從造模成功至實(shí)驗(yàn)取材期間每日腹腔注射丹參注射液，0．5mL／次，1次／日，臨床用量：30g生藥／20（mL·d）。丹參注射液臨床等效劑量＝30g生藥／日×0．018×5＝2．7g生藥／（kg·d）或2mL／（kg·d）。按大鼠體表面積折算丹參注射液等效劑量：250g～300g大鼠的中劑量為0．5mL／d～0．6 mL／d，大劑量為1mL／d～1．2mL／d，小劑量為0．25mL／d～0．3mL／d，此研究中使用中劑量，按分組方案執(zhí)行使用療程。丹參注射液組：從造模成功開始連續(xù)使用丹參注射液腹腔注射，0．5mL／次，1次／日，連用7d。模型對(duì)照組：從造模成功開始連續(xù)使用與丹參注射液等劑量的生理鹽水，連用7d。假手術(shù)組：大鼠入選后不予用藥。

1．5 檢測(cè)指標(biāo)

1．5．1 神經(jīng)功能損傷程度評(píng)分（NSS） 造模完成后1d、3d及7d評(píng)分。評(píng)分范圍0～18分，分?jǐn)?shù)越高表明大鼠的神經(jīng)功能缺損越重。

1．5．2 腦組織VEGF表達(dá) ELISA法檢測(cè)：加入100μL配制好的每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品到反應(yīng)孔中，用覆膜蓋好并37℃溫育2 h。棄去孔內(nèi)液體。每孔加檢測(cè)液A 100μL，晃勻后加上覆膜，37℃溫育60min。棄去孔內(nèi)液體并用稀釋好的洗滌液洗板3次。每孔加檢測(cè)液B 100μL，37℃溫育60min。加入90μL底物到每個(gè)反應(yīng)孔。避光，37℃溫育30min。加入50μL終止液到每個(gè)反應(yīng)孔中，立即用酶標(biāo)儀在450nm波長下依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為腦組織VEGF濃度。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18．0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布多組資料采用單因素方差分析，兩組資料采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布者進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化后比較，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

2 結(jié) 果

2．1 3組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 在腦梗死后，丹參注射液組和對(duì)照組表現(xiàn)出一致性變化趨勢(shì)，均有下降趨勢(shì)，假手術(shù)組基本無變化，只作為正常對(duì)照，不做特殊討論。丹參注射液組在3d、7d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較，NSS評(píng)分有明顯下降（P＜0．01），丹參注射液腹腔注射后能從行為學(xué)上改善大鼠的神經(jīng)功能。詳見表1。

表1 3組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分（±s） 分

表1 3組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分（±s） 分

與對(duì)照組比較，1）P＜0．01；與假手術(shù)組比較，2）P＜0．01

組別 n 1d 3d 7d丹參注射液組 12 9．25±2．05 4．67±1．831）2） 4．08±1．881）2）對(duì)照組 12 9．33±2．70 7．91±2．022）3） 7．75±1．542）假手術(shù)組 12 0 0 0

2．2 3組大鼠治療后VEGF表達(dá) 在腦梗死后，3組VEGF表達(dá)呈現(xiàn)不一致性變化趨勢(shì)，丹參注射液組在3d及7dVEGF濃度高于對(duì)照組及假手術(shù)組，血液中VEGF濃度太低，無法測(cè)定。丹參注射液組與對(duì)照組比較，腦組織VEGF有增高趨勢(shì)，提示丹參注射液可上調(diào)ACI后VEGF的表達(dá)（P＜0．05）；丹參注射液組與假手術(shù)組比較，腦組織VEGF有增高（P＜0．05）；對(duì)照組與假手術(shù)組比較，對(duì)照組VEGF有增高趨勢(shì)，表明ACI后，腦組織VEGF會(huì)應(yīng)激性增高（P＜0．05）；丹參注射液3d和7d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比，VEGF表達(dá)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。丹參注射液能延緩ACI后VEGF下調(diào)的時(shí)間，持續(xù)刺激VEGF的高表達(dá)，對(duì)于促進(jìn)神經(jīng)及血管的修復(fù)有積極的意義。詳見表2。

表2 3組腦組織VEGF表達(dá)（±s） pg／mL

表2 3組腦組織VEGF表達(dá)（±s） pg／mL

與對(duì)照組比較，1）P＜0．05；與假手術(shù)組比較，2）P＜0．05

組別 n 3d 7d丹參注射液組 12 230．34±59．391）2） 264．30±55．911）對(duì)照組 12 179．73±35．282） 194．24±30．92假手術(shù)組 12 142．19±28．56 142．19±28．56

3 討 論

急性腦梗死后神經(jīng)功能缺損的本質(zhì)是中樞神經(jīng)細(xì)胞的壞死，一般認(rèn)為中樞神經(jīng)細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，缺乏再生能力。腦梗死后，除損傷區(qū)域的神經(jīng)組織直接受損外，由此導(dǎo)致的繼發(fā)性動(dòng)力性損傷也很重要。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為急性腦梗死屬于“中風(fēng)”的范疇，無論從病因病機(jī)分析，都存在“瘀血阻絡(luò)”的因素，因此活血通絡(luò)對(duì)于急性腦梗死的治療尤為重要。而丹參注射液的作用主要著眼于“活血化瘀”這個(gè)環(huán)節(jié)，這也為本實(shí)驗(yàn)提供了客觀的理論依據(jù)。

既往的研究已證實(shí)，VEGF是一種多效性血管生長因子，具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，提高血管通透性等生物學(xué)特性，在缺血的腦組織中對(duì)于神經(jīng)血管重塑發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。一方面VEGF能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增生遷移、增強(qiáng)毛細(xì)血管的通透性、增加腦血流［2］、具有強(qiáng)效的抗炎、抗凋亡［3］以及免疫抑制特性的作用［4］；另一方面VEGF及其受體還是一種獨(dú)立的神經(jīng)保護(hù)因子，對(duì)神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞有保護(hù)效應(yīng)［5］，可以增強(qiáng)神經(jīng)前體細(xì)胞的募集及增殖作用，能夠直接促進(jìn)損傷后的大腦皮層神經(jīng)元再生、突觸重塑以及健側(cè)皮質(zhì)延髓束長距離軸突的再生［6］。因此，VEGF的血管修復(fù)性、親神經(jīng)性及神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)性，成為聯(lián)系血管生成和神經(jīng)再生中最重要的“樞紐”。

丹參為唇形科植物，味苦，性微寒。具有活血祛瘀、養(yǎng)血安神、調(diào)經(jīng)止痛、涼血消癰的功效。丹參的有效成分主要分為脂溶性和水溶性兩大類。丹參注射液屬于水溶性藥物，以酚性酸類化合物為主。藥理研究表明丹參注射液中的單體成分丹酚酸B可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌某些細(xì)胞因子，并促進(jìn)毛細(xì)血管的形成［7］，丹酚酸B的代謝產(chǎn)物SMND－309可通過激活EPO受體／STAT3信號(hào)通路上調(diào)VEGF的表達(dá)促進(jìn)血管的發(fā)生［8］，丹參注射液中其他單體成分如丹參酮、丹參素均能促進(jìn)干細(xì)胞向神經(jīng)元巢蛋白及絲蛋白方向分化［9，10］，分化過程中可產(chǎn)生與細(xì)胞生長相關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，如VEGF、IGF及BFGF等，這些細(xì)胞因子可通過自分泌或旁分泌的方式，刺激局部血管和神經(jīng)元細(xì)胞的增生，抑制缺血區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，在改善神經(jīng)缺損功能方面起著十分重要的作用。另外，丹參注射液自身還能促進(jìn)心肌梗死大鼠缺血心肌VEGF、BFGF及PDGF－B蛋白的表達(dá)［11］，發(fā)揮促血管新生及腦保護(hù)的作用。

本實(shí)驗(yàn)丹參注射液組中大鼠腦組織VEGF在3d和7d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均呈高表達(dá)、NSS評(píng)分下調(diào)，與對(duì)照組、模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，丹參注射液在急性腦梗死大鼠模型中，可促進(jìn)大鼠腦組織中VEGF的分泌，改善大鼠神經(jīng)行為學(xué)的功能，丹參注射液可通過上調(diào)VEGF的水平，優(yōu)化局部的微環(huán)境，而局部VEGF的持續(xù)增多，又可能特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞（包括神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞）促進(jìn)血管及神經(jīng)的共同修復(fù)［1］，對(duì)于加強(qiáng)血管發(fā)生及神經(jīng)重塑的聯(lián)系有積極作用，具有進(jìn)一步的研究價(jià)值。

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