辛伐他汀對壓力超負(fù)荷大鼠心肌NADPH氧化酶基因表達(dá)的影響

李紹彩，史富華，黃宇玲，張晉霞

心肌重構(gòu)可導(dǎo)致心臟肥厚和心室壁僵硬度增加，最終心功能惡化引起心力衰竭。NADPH氧化酶在心血管疾病的發(fā)生和進(jìn)展中具有重要作用，如內(nèi)皮功能障礙、動脈粥樣硬化、糖尿病血管病變、腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)（RAAS）相關(guān)的高血壓和缺血性血管重塑［1］。血管NADPH氧化酶激活產(chǎn)生的活性氧增多形成的氧化應(yīng)激在心肌肥大發(fā)展過程中的重要作用也越來越受到重視。NADPH氧化酶的催化亞基Nox家族在心血管細(xì)胞中包含多個亞型，它們在不同病理刺激因素作用下介導(dǎo)不同的病理過程。他汀類藥物為羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMG－CoA）抑制劑，是新一代調(diào)脂藥物。目前應(yīng)用于臨床的主要有辛伐他?。╯imvastatin，SIM）、洛伐他?。╨ovastatin）、普伐他汀（pravastatin）和阿托伐他?。╝torvastatin）等。他汀類除具有調(diào)脂作用外還具有其他多種作用，如改善內(nèi)皮功能、改善血液流變學(xué)、抑制炎癥反應(yīng)、穩(wěn)定斑塊、抑制平滑肌細(xì)胞增殖等作用，他汀類可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)改善左室重塑。本研究通過腹主動脈結(jié)扎的方法復(fù)制心肌肥大模型，觀察壓力超負(fù)荷所致心肌肥大的過程中NADPH氧化酶不同Nox亞型的表達(dá)變化，以及辛伐他汀對壓力超負(fù)荷大鼠心肌NADPH氧化酶基因表達(dá)的作用，探索他汀類藥物抑制心肌肥大的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 動物 雄性SD大鼠220g～250g。由華北煤炭醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。辛伐他汀為德國Merck Sharp＆Dohme公司生產(chǎn)原粉。DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。二甲基亞砜（DMSO）、牛胰蛋白酶為美國Sigma公司產(chǎn)品，胎牛血清（FBS）為美國Gibco公司產(chǎn)品。RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒為美國Fermentas產(chǎn)品：TrizolReagent購自美國Invitrogen公司。

1．2 方法 腹主動脈縮窄模型（AC）建立。戊巴比妥鈉麻醉后固定，在分離的腹主動脈下方穿線，與－10號針頭結(jié)扎在一起，使腹主動脈形成環(huán)形縮窄。檢查結(jié)扎處，若搏動正常且腹后壁無出血，即可逐層縫合腹壁。肌注青霉素5×104U／只，以預(yù)防感染。假手術(shù)組除不結(jié)扎分離的腹主動脈外，其余操作均同手術(shù)組。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)，正常飲水。

1．3 實驗分組 將動物隨機(jī)分為3組，每組10只。腹主動脈縮窄組（Model）；假手術(shù)組（Sham）；辛伐他汀組（SIM）：腹主動脈縮窄術(shù)后1h給予辛伐他汀，每日清晨灌胃10mg／（kg·d）。在術(shù)后6周測量各組動物體重及血壓，并進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的測定。

1．4 測定指標(biāo)

1．4．1 心臟超聲心動圖 戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉，用Hp Sonos2500型多功能超聲檢查儀及7．5MHz相控陣探頭（美國惠普公司）檢測左室收縮末內(nèi)徑（LVEDD）、舒張末內(nèi)徑（LVESD）等，計算左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、短軸縮短率（LVFS）。1．4．2 血流動力學(xué)檢測 記錄左室收縮末壓（LVESP）、左室舒張末壓（LVEDP）及左室內(nèi)壓最大上升、下降速率（±dP／dtmax）。

1．4．3 心肌肥大指數(shù) 各組動物摘取心臟。測量全心重、左心室重，計算心室重與體重比值（V／Bwt，Hermann Wilson’s公式）作為心肌肥大指數(shù)。

1．4．4 實時定量PCR法測定 Nox2、Nox4和p47phox的mRNA轉(zhuǎn)錄變化 。Trizol法提取心肌組織中的總RNA，測定總RNA純度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國Fermentas公司）說明書，取2μg總RNA樣本在10μL體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在20μL體系中擴(kuò)增。Western印跡法檢測 Nox2、Nox4和p47phox的蛋白表達(dá)的變化。

1．5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用SNK法。

2 結(jié) 果

2．1 各組終點血壓測定 各組大鼠實驗終點進(jìn)行血壓測定，Sham 組為107．16mmHg±7．03mmHg，Model組為171．47 mmHg±18．93mmHg，SIM 組為121．82mmHg±12．56mmHg。其中，Model組血壓較Sham組明顯升高（P＜0．01）；V／Bwt的測定中，Model組（3．87±0．34）較Sham組（2．11±0．12）明顯升高（P＜0．01），SIM 組 V／Bwt（2．23±0．76）較 Model組下降，造模成功。

2．2 超聲心動圖指標(biāo) 與Sham組相比，Model組的LVEF、LVFS明顯降低（P＜0．01），而LVEDD、LVESD明顯增大（P＜0．01）；與 Model組相比，SIM 組的LVEF、LVFS明顯升高（P＜0．01），LVEDD、LVESD明顯下降（P＜0．01）。詳見表1。

表1 各組大鼠超聲心動圖指標(biāo)（±s）

表1 各組大鼠超聲心動圖指標(biāo)（±s）

與Sham組比較，1）P＜0．01；與 Madel組比較，2）P＜0．01

組別 n LVESD（mm） LVEDD（mm） LVEF（%） LVFS（%）Sham組 12 3．78±0．32 6．97±0．11 89．97±7．62 62．19±5．34 Model組 12 8．13±0．591） 9．82±0．391） 52．15±3．241） 27．29±7．661）SIM 組 12 5．48±0．622） 7．24±0．942） 78．93±6．772） 49．33±5．612）

2．3 血流動力學(xué)指標(biāo) 與Sham組相比，Model組的±dp／dtmax、LVESP明顯降低 （P＜0．01），LVEDP明顯升高（P＜0．01）；與Model組相比，SIM 組±dp／dtmax、LVESP明顯升高（P＜0．01），LVEDP明顯降低（P＜0．01）。詳見表2。

表2 各組大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)（±s）

表2 各組大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)（±s）

與Sham組比較，1）P＜0．01；與 Model組比較，P＜0．01

組別 n LVESP（mmHg） LVEDP（mmHg） ＋dp／dtmax（mmHg／s） －dp／dtmax（mmHg／s）Sham組 12 120．17±10．01 5．12±0．99 5 021．07±221．17 4 198．23±143．21 Model組 12 84．32±6．941） 12．43±1．541） 3 301．27±190．111） 2 435．23±333．211）SIM 組 12 98．72±5．432） 7．33±1．082） 4 651．67±298．172） 3 298．12±201．112）

2．3 各組Nox2、Nox4和p47phox表達(dá)的變化 與Sham組相比，Model組的大鼠心肌中Nox2、Nox4和p47phoxmRNA及蛋白表達(dá)升高（P＜0．01）；SIM組較 Model組心肌中Nox2、Nox4和p47phoxmRNA及蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0．01）。詳見圖1、圖2。

圖1 Rail time－PCR法檢測心肌組織中Nox2、Nox4和p47phox表達(dá)

圖2 Western blot法檢測心肌組織中Nox2、Nox4和p47phox表達(dá)

3 討 論

心肌肥厚是心臟對機(jī)械負(fù)荷及神經(jīng)體液因子改變的代償性反應(yīng)，是發(fā)生心肌缺血、心律失常的獨立危險因子［2］，氧化應(yīng)激在心臟病變中起重要作用［3－7］。氧化應(yīng)激是由于機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生活性氧（ROS）增多，超過了體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的消除能力所導(dǎo)致的氧化還原狀態(tài)的失平衡［8］。高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病血管病變、心衰等心血管疾病病理發(fā)展過程中ROS主要來源于血管NADPH氧化酶，其與巨噬細(xì)胞NADPH氧化酶在結(jié)構(gòu)上很相似，但表達(dá)和調(diào)節(jié)上又有很多區(qū)別［9，10］。NADPH氧化酶是體內(nèi)唯一被發(fā)現(xiàn)的主要功能是產(chǎn)生ROS的酶，它對許多氧化還原敏感的信號通路有非常重要的作用。NADPH氧化酶產(chǎn)生的ROS可以使一氧化氮合酶（NOS）失偶聯(lián)，還能激活黃嘌呤氧化酶，產(chǎn)生更多的ROS，使氧化應(yīng)激放大［11］。心血管NADPH氧化酶的催化亞基是不同的Nox同系物和p22phox，它們組成膜復(fù)合體細(xì)胞色素b558，位于胞漿顆粒和漿膜上；調(diào)節(jié)亞基包括p47phox、p67phox、p40phox和Rac，它們可組成另一個蛋白復(fù)合體，存在于胞漿。NADPH氧化酶可被多種病理生理刺激因子通過不同的Nox亞基特異性激活，產(chǎn)生不同的下游效應(yīng)［8，9，12］。心血管系統(tǒng)中主要有 Noxl、Nox2、Nox4，Nox2在內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）、成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞中豐富表達(dá)；Noxl在血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）中高表達(dá)，但在ECs和心肌細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)；Nox4表達(dá)廣泛，在ECs和心肌細(xì)胞中均高表達(dá)。不同的心血管疾病病理因子，如血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、細(xì)胞因子、機(jī)械張力等，刺激不同的Nox亞型激活，不同的Nox亞型激活后啟動病理變化也可能不同。Nox2型NADPH氧化酶在AngⅡ依賴性的心肌細(xì)胞肥大、心內(nèi)膜纖維化，以及壓力超負(fù)荷型左心肥厚（LVH）誘發(fā)的心臟收縮失常等發(fā)展過程中起重要的介導(dǎo)作用。而壓力超負(fù)荷所致的心肌細(xì)胞肥大卻可能與Nox4有關(guān)［13，14］。

阿托伐他汀可以抑制同型半胱氨酸（Hcy）誘導(dǎo)的NADPH氧化酶活性，通過抑制重要的NADPH氧化酶Noxl亞基mRNA的表達(dá)、抑制內(nèi)皮Nox4過表達(dá)和形成有活性的p22phox復(fù)合體而發(fā)揮細(xì)胞的抗氧化作用［15］。黎健等［16］研究顯示高濃度（0．8g／L）LDL刺激 HUVEC時，Nox4表達(dá)上凋，細(xì)胞內(nèi) ROS生成增加。用辛伐他汀預(yù)處理再加高濃度LDL刺激時，Nox4表達(dá)下降，ROS生成量減少。提示辛伐他汀可下調(diào)HUVEC中Nox4的表達(dá)，降低ROS水平，進(jìn)一步在體內(nèi)證明辛伐他汀的抗氧化作用。

本研究結(jié)果表明，壓力超負(fù)荷性所致心肌肥大過程中NADPH氧化酶亞型Nox2、Nox4和調(diào)節(jié)亞基p47phox基因及蛋白水平均增高，而辛伐他汀的干預(yù)可逆轉(zhuǎn)這種增高，進(jìn)而抑制ROS產(chǎn)生信號系統(tǒng)，導(dǎo)致NADPH氧化酶活性降低，改善肥大心肌的功能。他汀類藥物具有獨立于降脂作用以外保護(hù)肥大心肌細(xì)胞的作用。

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