血管緊張素原基因T174M位點多態(tài)性和α－內(nèi)收蛋白基因多態(tài)性與高血壓腦梗死的相關(guān)性研究

李廣強，李宏芬，袁建新，王穎杰

遺傳因素在腦梗死發(fā)病中起重要作用。血管緊張素原作為腎素－血管緊張素系統(tǒng)（RAS）唯一的初始反應底物，在腦梗死的發(fā)生、發(fā)展中起著相當重要的作用。α－內(nèi)收蛋白是細胞膜陽離子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)內(nèi)收蛋白的一個亞單位，與膜蛋白（如離子通道及離子泵）相互作用，參與細胞信號轉(zhuǎn)導及細胞膜離子轉(zhuǎn)運，尤其與多種Na＋轉(zhuǎn)運機制密切相關(guān)。本研究采用單核苷酸多態(tài)性分析探討血管緊張素原基因T174M位點和α－內(nèi)收蛋白基因的多態(tài)性與腦梗死的關(guān)系，為腦梗死易患者的篩檢、識別、預防和診斷治療提供一定的理論數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1．1 研究對象 選取2007年1月—2009年1月在開灤總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的首次發(fā)病72h內(nèi)的住院腦梗死患者396例（病例組），男性286例，女性110例，年齡52歲～78歲（64．69歲±11．58歲）。選取同期健康查體者且結(jié)果均正常的360例為對照組，男性242名，女性118名，年齡51歲～75歲（65．59歲±10．90歲）。兩組資料性別、年齡匹配，具有可比性。

1．2 方法

1．2．1 診斷標準 腦梗死診斷依據(jù)1995年全國第四屆腦血管病會議制定標準，原發(fā)性高血壓診斷標準依據(jù)1999WHO／ISH高血壓處理指南。除外：具有心臟瓣膜、房顫、腫瘤等明顯栓子來源的腦栓塞性疾病；既往有腦梗死、腦出血病史；肝腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病患者；一個月內(nèi)有各種炎癥病史者。

1．2．2 DNA提取 用一次性采血器采集空腹靜脈血5mL（0．5mmol／L EDTA－K2抗凝），低滲法分離白細胞，Tris－HCl飽和酚、氯仿－異戊醇法提取DNA，用于檢測基因型。

1．2．3 基因多態(tài)性的檢測 血管緊張素原基因T174M多態(tài)性的檢測：AGT基因T174M引物參照Frossard等［1］的設(shè)計，上游引 物：5’GATGCGCACAAGGTCCTG3’；下 游 引 物：5’CAGGGTGCTGTCCACACTG GCTCGC3’（上海生工）。PCR反應體系及條件：PCR反應混合液25μL，其中含DNA模板（0．5～1）μg，引物（2pmol／μL）各0．5μL，2×Taq PCR Master－Mix12．5μL，無菌雙蒸水9．5μL，混勻后，應用PE－9700擴增儀（美國PE公司）進行PCR反應，預變性94℃4min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果：AGT基因T174M PCR擴增產(chǎn)物為303bp的DNA片段。

AGT基因擴增產(chǎn)物10μL，加1．25μL內(nèi)切酶 NcoⅠ（10U／μL），10×BufferB 2μL，6．75μL無菌蒸餾水，37 ℃水浴過夜后終止酶切反應。2．5%瓊脂糖凝膠電泳分型。若酶切后電泳只得到303bp條帶則為TT型，酶切后產(chǎn)生303bp、211bp和92bp條帶為TM型，產(chǎn)生211bp和92bp兩條帶為MM型。

α－內(nèi)收蛋白基因G460T多態(tài)性的檢測：α－內(nèi)收蛋白基因G460T引物參照Beeks等［2］的設(shè)計，上游引物：5’CTCCTTTGCTAGTGACGG－ TGATTC3’；下游引物：5’GACTTGGGACT GCTTCCATTCGGCC3’（上海生工）。PCR反應體系及條件：PCR反應混合液25μL，其中含DNA模板（0．5～1）μg，引物（2pmol／μL）各0．5μL，2×Taq PCR MasterMix12．5μL，無菌雙蒸水9．5μL，混勻后，應用PE－9700擴增儀（美國PE公司）進行PCR反應，預變性94℃4min，94℃變性30s，60℃退火30s，40個循環(huán)。擴增產(chǎn)物用2．5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果：α－內(nèi)收蛋白基因PCR擴增產(chǎn)物為147bp的DNA片段。

α－內(nèi)收蛋白基因擴增產(chǎn)物10μL，加1．25μL內(nèi)切酶Cfr13Ⅰ（10U／μL），2μL 10×BufferB，6．75μL無菌蒸餾水，37℃水浴過夜后終止酶切反應。2．5%瓊脂糖凝膠電泳分型。若酶切后電泳只得到147bp條帶則為GG型，酶切后產(chǎn)生147bp、122bp和25bp條帶為GT型，產(chǎn)生122bp和25bp的為TT型。1．2．4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13．0分析?；蛐?、等位基因頻率比較采用χ2檢驗，兩組間計量資料比較采用t檢驗，多因素危險分析采用Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2．1 Hardy－Weiberg遺傳平衡定律檢測 對照組中血管緊張素原基因T174M位點TT、TM兩種基因型頻率分別為94．2%，5．8%；T、M 等位基因頻率分別為97．1%，2．9%（χ2＝0．00035；P＞0．05）。同樣，對照組中α－內(nèi)收蛋白基因GG、GT、TT三種基因型頻率分別為22．8%、51．7%、25．6%；G、T等位基因頻率分別為48．6%、51．4%（χ2＝0．420；P＞0．05）。群體檢驗血管緊張素原基因頻率和α－內(nèi)收蛋白基因頻率符合Hardy－Weiberg平衡定律。該結(jié)果提示被研究群體有良好的平衡性和代表性。

2．2 AGT基因T174M基因型與腦梗死的關(guān)系 病例組AGT基因174位 點 的TT基 因 型88．7% （3 5 1／3 9 6），TM基 因 型11．3% （45／396）。對照組 TT 基因型94．2%（339／360），TM 5．8% （21／360），兩組基因型頻率比較（χ2＝7．238，P＜0．05）；等位基因頻率腦梗死患者 T：94．3%（747／792），M：5．7%（45／792），對照組 T：97．1%（699／720），M：2．9%（21／720），兩組等位基因頻率比較（χ2＝6．908，P＜0．05）。用 OR值做患病風險評估，攜帶AGT基因174TM基因型的患病風險是AGT基因174TT基因型的2．070倍；攜帶M等位基因者的患病風險是T等位基因的2．005倍。

2．3 按高血壓分層 病例組中有高血壓患者302例，TT基因型83．4%，TM基因型16．6%；非高血壓患者94例中，TT基因型93．6%，TM基因型6．4%。高血壓患者等位基因頻率T：91．7%，M：8．3%，非高血壓人群 T：96．8%，M：3．2%。攜帶TM基因型及M等位基因者的患病風險分別是TT基因型和T等位基因的2．910倍和2．738倍。

2．4 α－內(nèi)收蛋白G460T基因多態(tài)性與腦梗死的關(guān)系 病例組α－內(nèi)收蛋白G460T位點的GG基因型22．2%（88／396），GT基因型52．0%（206／396），TT 基因型25．8%（102／396）。對照組 GG基因型22．8%（82／360），GT基因型51．7%（186／360），TT基因型25．6%（92／360），兩組基因型頻率比較（χ2＝0．033，P＞0．05）。等位基因頻病例組G：48．2%（382／792），T：51．8%（410／792）。對照組 G：48．6%（350／720），T：51．4%（370／720），兩組等位基因頻率比較（χ2＝0．022，P＞0．05）。

2．5 AGT基因T174M與α－內(nèi)收蛋白G460T聯(lián)合基因型與腦梗死關(guān)系 將AGT基因T174M位點與α－內(nèi)收蛋白G460T位點多態(tài)進行聯(lián)合基因型分析，比較不同基因型組合在病例組對照組間的差異性，TM＋GT、TM＋TT兩種基因型組合在兩組分布有統(tǒng)計學意義（χ2＝8．125，P＜0．05；χ2＝4．680，P＜0．05）。詳見表1。

表1 AGT基因T174M與α－內(nèi)收蛋白G460T聯(lián)合基因型比較 例（%）

3 討 論

腦梗死是一個包括環(huán)境、遺傳在內(nèi)的多致病因素的綜合征，高血壓、高血糖、肥胖、吸煙、血脂異常等均為腦梗死發(fā)病的危險因素［3－5］，除此之外，隨著分子遺傳學研究的深入，尋找其相關(guān)致病基因并揭示相應發(fā)病機制，已經(jīng)成為近幾年的研究重點。

AGT是RAS的唯一底物，AGT多態(tài)位點基因突變可能導致AGT的濃度升高，使血壓升高，增加腦梗死的風險。目前國內(nèi)外對AGT基因T174M多態(tài)性與腦梗死的關(guān)系的研究尚少［6］。本研究對T174M多態(tài)性檢測結(jié)果表明，T174M多態(tài)基因型與等位基因在兩組中的分布明顯不同，攜帶TM基因型及M等位基因者的患病風險是TT基因型及T等位基因的2．070倍和2．005倍。經(jīng)Logistic回歸分析校正混雜危險因素后，TM基因型仍為腦梗死的危險因素。該結(jié)果與劉艷等［7］的研究結(jié)論一致，提示攜有AGT基因T174M位點TM基因型的個體可能是腦梗死發(fā)生的高危人群。此外，病例組按是否為高血壓患者分層后，攜帶AGT基因174TM基因型及M等位基因者患病風險是174TT基因型及T等位基因的2．9 1 0倍、2．7 3 8倍，與Hegele等［8］對741例Hutterites人調(diào)查得出AGT基因變異與高血壓關(guān)聯(lián)，收縮壓改變與T 174M位點突變有顯著關(guān)系的結(jié)論相一致。本結(jié)果再次證實高血壓是腦梗死的危險因素，且不排除AGT基因T174M基因多態(tài)致腦梗死發(fā)病過程中與高血壓因素有協(xié)同作用。

目前，大量研究除了集中在神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)領(lǐng)域外，還有鹽平衡領(lǐng)域［9－11］。α－內(nèi)收蛋白基因可能是一種鹽敏感基因，人群受不同生活環(huán)境和生活方式的影響，在不同的鹽攝入水平上遺傳因子的作用也有明顯差別［12］。本研究結(jié)果顯示，α－內(nèi)收蛋白多態(tài)基因型及等位基因在兩組間無統(tǒng)計學意義，提示G460T多態(tài)性可能與腦梗死的發(fā)病無關(guān)。

α－內(nèi)收蛋白基因突變可影響Na＋－H＋交換、Na＋－K＋－Cl－協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)運，增加腎鈉重吸收，同時血漿腎素活性降低，血管緊張素Ⅱ的Ⅰ型和2型受體上調(diào)，組織或局部的腎素－血管緊張素系統(tǒng)通過自分泌和旁分泌產(chǎn)生血管緊張素Ⅱ與兩種上調(diào)受體結(jié)合，導致血管平滑肌細胞增殖、肥大，引起血管壁變厚、順應性降低。將AGT基因T174M位點多態(tài)與α－內(nèi)收蛋白G460T位點多態(tài)進行聯(lián)合基因型分析，TM＋GT、TM＋TT基因型組合在兩組分布有統(tǒng)計學意義，其患病風險分別增加了3．253倍和3．791倍，提示兩組合基因型可能是腦梗死的易感因素，AGT基因T174M位點多態(tài)與α－內(nèi)收蛋白基因多態(tài)性之間可能存在基因間的協(xié)同作用。多位點突變可能對腦梗死致病有協(xié)同作用，遠大于各單一效應算術(shù)和，從而成為危險因素。Nakamura等［13］、鐘 發(fā) 德 等［14］對 α－adducing Gly 460Trp、AGT Met235Thr基因交互作用進行了研究，均發(fā)現(xiàn)兩基因同時存在時患高血壓的風險較大。因此，臨床聯(lián)合檢測AGT基因T174M位點與α－內(nèi)收蛋白G460T位點多態(tài)性的改變對高血壓腦梗死更具臨床意義。

［1］ Frossard PM，Lestringant GG，Elshahat YI，et al．AnMbo I two allele polymorphism may implicate the human reningene in primary hypertension［J］．Hypertens Res，1998，21（1）：221－223．

［2］ Beeks E，Klauw MM ，Kroon AA，et al．Alph－adducin Gly460Trp polymorphism and renal hemodynamics in essential hypertension［J］．Hypertension，2004，44（4）：419－423．

［3］ 和姬苓，王永福，楊國安，等．血管緊張素Ⅱ受體1基因多態(tài)性與腦血管病的關(guān)系［J］．臨床神經(jīng)病學雜志，2007，20（1）：12－13．

［4］ Porter A，Assali AR，Zahalka A，et al．Impaired fasting glucose and outcomes of ST－elevation acute coronary syndrome treated with primary percutaneous intervention among patients without previously known diabetes mellitus［J］．Am Heart J，2008，155（2）：284－289．

［5］ Hlalky MA，Quertermous T，Boothroyd DB，et al．Polymorphisms in hypoxia inducible factor 1and the initial presentation of coronary disease［J］．Am Heart J，2007，154（6）：1035－1042．

［6］ 張勇，金水晶，周代鋒，等．血管緊張素原基因兩個多態(tài)位點與海南地區(qū)漢族腦梗死的關(guān)系［J］．中國老年學雜志，2010，30（9）：1189－1190．

［7］ 劉艷，金瑋，姜正文，等．血管緊張素原基因T174M和 M 235T多態(tài)與腦梗塞的關(guān)系［J］．上海第二醫(yī)科大學學報，2004，24（5）：351－353．

［8］ Hegele RA，Bruntj H，Connelly PW．A polymorphism of the Angioten sinogen gene associated with variation in blood pressure in genetic isolate［J］．Circulation，1994，90（5）：2207－2212．

［9］ 劉興德，陳保林，李金生，等．β2腎上腺素能受體基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性研究［J］．臨床心血管病雜志，2005，21（2）：84－86．

［10］ 劉輝，李南方，李濤，等．β2腎上腺素能受體基因Gln27Glu多態(tài)性與新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓的相關(guān)研究［J］．臨床心血管病雜志，2005，21（7）：426－429．

［11］ 惠杰，肖濱，楊向軍，等．原發(fā)性高血壓患者血管緊張素轉(zhuǎn)化酶基因多態(tài)性與血管內(nèi)皮損傷的相關(guān)性［J］．臨床心血管病雜志，2006，22（10）：577－579．

［12］ Wang JG，Staessen JA，Messaggio E，et al．Salt，Endogenousouaain and blood pressure interactions in the general population［J］．Hypertension，2003，21（8）：1475－1481．

［13］ Nakamura Y，Tabara Y，Miki T，et al．Both angiotensinogen M235Tand alpha－adducin G460Wpolymorphisms are associated with hypertension in the Japanese population［J］．Hypertension，2007，21（3）：253－255．

［14］ 鐘發(fā)德，張莉娜，徐進，等．Alpha－內(nèi)收蛋白G460T和血管緊張素原 M235T基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓發(fā)病風險相關(guān)［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床雜志，2011，31（1）：62－67．