幾種香料植物提取物對(duì)大腸桿菌抑制作用的試驗(yàn)

李利紅，陳忠杰，盧婷婷，解克偉

（1．鄭州牧業(yè)工程高等專科學(xué)校藥物工程系，河南 鄭州450011；2．禹州森源本草天然產(chǎn)物有限公司，河南 禹州461683）

致病性大腸桿菌病是現(xiàn)代規(guī)?；?、集約化畜禽養(yǎng)殖的主要傳染病之一，目前尚無(wú)理想的疫苗來(lái)預(yù)防，臨床主要采用抗菌藥物治療。近年來(lái)，由于抗菌藥物的持續(xù)和不恰當(dāng)?shù)厥褂?，大腸桿菌耐藥機(jī)制不斷變遷，耐藥性不斷提高［1－3］，導(dǎo)致抗菌藥物的療效降低甚至失去療效；大腸桿菌耐藥現(xiàn)象已經(jīng)成為現(xiàn)代畜牧業(yè)健康養(yǎng)殖的限制性瓶頸，而抗菌藥物不規(guī)范使用所帶來(lái)的的環(huán)境衛(wèi)生和食品安全問(wèn)題也已越來(lái)越受世人關(guān)注，因此如何選用對(duì)大腸桿菌有較好抑制作用的藥物是當(dāng)今獸醫(yī)臨床的主要任務(wù)之一。中草藥具有來(lái)源廣、副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，已經(jīng)成為現(xiàn)代預(yù)防和控制細(xì)菌性感染疾病方面的重要研究對(duì)象［4－5］。近年來(lái)關(guān)于中藥芳香性物質(zhì)的抗微生物活性報(bào)道很多［6－8］，但是關(guān)于其對(duì)大腸桿菌抑制效果的研究報(bào)道不多，因此，本試驗(yàn)選取丁香、八角茴香和迷迭香3種香料植物，提取其中的5種主要成分，在體外研究其對(duì)大腸桿菌的抑制作用，期望為獸醫(yī)臨床合理使用中草藥提取物防治大腸桿菌病提供理論和試驗(yàn)依據(jù)，為研究和開發(fā)抗菌中藥解決耐藥菌株的產(chǎn)生和抗生素短缺問(wèn)題提供途徑。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

1．1．1 試驗(yàn)材料 迷迭香采自河南禹州森源本草天然產(chǎn)物有限公司種植基地，其他藥材購(gòu)自鄭州零售藥店。

所用菌株分別為：大腸桿菌（標(biāo)準(zhǔn)型）；大腸桿菌（臨床致病型，從犢牛稀糞便中分離）。菌株由鄭州牧業(yè)工程?？茖W(xué)校藥物工程系實(shí)驗(yàn)室提供。

1．1．2 主要儀器與試劑 CTXNW－2B循環(huán)超聲萃取儀（北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；R－1001－VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；RE－5210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮）；LXJ－IIB離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；P230II高效液相色譜儀（上海依利特）；BT125D十萬(wàn)分之一分析天平（賽多利斯），阿貝折射儀（上海宇隆2W）。

鼠尾草酸和迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品，均由禹州森源本草天然產(chǎn)物有限公司提供；重蒸水，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

1．2 方法

1．2．1 精油的提取制備 稱取丁香、八角茴香和迷迭香藥材各500g，用水蒸氣蒸餾法提取各自的揮發(fā)油，20℃以下測(cè)定相對(duì)密度和折光率。

1．2．2 迷迭香酸和鼠尾草酸的提取制備 稱取提取過(guò)精油的迷迭香殘?jiān)?00g，用40倍體積的90%乙醇進(jìn)行回流提取1h（加少許檸檬酸），將提取液進(jìn)行過(guò)濾，濾液和殘?jiān)謩e用來(lái)提取鼠尾草酸和迷迭香酸。濾液進(jìn)行減壓濃縮至1／5體積，4 000r／min離心，保留沉淀物，進(jìn)行真空干燥，稱重，用HPLC測(cè)定鼠尾草酸含量。殘?jiān)?0倍體積的水進(jìn)行超聲提取30min，過(guò)濾，對(duì)濾液進(jìn)行減壓濃縮和真空干燥，稱重，用HPLC測(cè)定迷迭香酸含量。

1．2．3 迷迭香酸和鼠尾草酸含量的測(cè)定 （1）鼠尾草酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：精密稱取105℃干燥4h后至質(zhì)量恒定的鼠尾草酸標(biāo)準(zhǔn)品10．0mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度定容，搖勻，其質(zhì)量濃度為1mg／mL作為標(biāo)準(zhǔn)溶液；（2）迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：精密稱取80℃下干燥至恒重的迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品10．0mg溶于10mL甲醇溶解并稀釋至刻度定容，得1mg／mL迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；（3）鼠尾草酸樣品測(cè)定：稱取鼠尾草酸提取物100mg，無(wú)水乙醇定溶至50mL，微孔濾膜過(guò)濾，超聲脫氣，HPLC測(cè)定。采用C18柱，流動(dòng)相為乙腈：0．1%磷酸＝60∶40，流速為1mL／min，230 nm測(cè)定；（4）迷迭香酸樣品測(cè)定：稱取迷迭香酸提取物100mg，甲醇定溶至50mL，微孔濾膜過(guò)濾，超聲脫氣，HPLC測(cè)定。采用C18柱，流動(dòng)相為甲醇∶0．05%磷酸＝45∶50，流速為0．6mL／min，283nm測(cè)定。均做平行試驗(yàn)3次，以峰面積按外標(biāo)法進(jìn)行定量計(jì)算。

1．2．4 菌種的復(fù)壯與擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行大腸桿菌的復(fù)壯和擴(kuò)增，用于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板涂菌。

1．2．5 涂菌 取制備好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基，分別加入100μL制備好的105CFU／mL菌液，用涂菌玻璃棒涂均勻。

1．2．6 打孔 用直徑為6．5mm的打孔器在涂菌的瓊脂培養(yǎng)基上均勻打孔，并編號(hào)，每種藥重復(fù)兩個(gè)平皿，每個(gè)平皿做3個(gè)孔?？讖酱笮?、深度保持均勻一致。打好孔后在酒精燈火焰上略微加熱，使局部培養(yǎng)基熔化重新凝固與平皿底部結(jié)合，防止加入的藥物從底部的縫隙流出。

1．2．7 加藥 將迷迭香酸和鼠尾草酸配制成含有效成分1mg／mL的水溶液，揮發(fā)油直接添加，分別加入各孔中，每孔加20μL藥液，置于恒溫箱中37℃條件下，培養(yǎng)24h。取出，量取抑菌圈直徑。每孔在不同方向測(cè)量2次，取平均值。

1．2．8 抑菌結(jié)果判定 抑菌效果判定，抑菌直徑＞20mm為極敏感，用“＋＋＋＋”表示；15～19mm為高敏感，用“＋＋＋”表示；10～14為中敏感，用“＋＋”表示；10mm以下為低敏感，用“＋”表示；“－－”表示無(wú)抑菌作用。

2 結(jié)果與分析

2．1 提取結(jié)果 迷迭香經(jīng)蒸餾、脫水后得到無(wú)色透明迷迭香油，提取率為1．5%（平均每100g原料得到1．5mL 精油），相對(duì)密度為0．869，折光率為1．466。丁香花蕾經(jīng)蒸餾、脫水后得到無(wú)色透明丁香油，提取率為9．5%（平均每100g原料得到9．5mL精油），相對(duì)密度為1．041，折光率為1．532。八角茴香經(jīng)蒸餾、脫水后得到無(wú)色透明八角茴香油，提取率為5．3%（平均每100g原料得到5．3mL精油），相對(duì)密度為0．982，折光率為1．555。鼠尾草酸的提取率為7%；迷迭香酸的提取率為4%。

2．2 迷迭香酸和鼠尾草酸含量測(cè)定結(jié)果 230nm下，經(jīng)HPLC測(cè)定，鼠尾草酸的純度為16．24%；迷迭香酸的純度為5．37%。

2．3 藥物敏感性測(cè)定結(jié)果 幾種提取物的抑菌圈測(cè)定結(jié)果見表1所示。

表1 抑菌圈測(cè)定

由表1可見，鼠尾草酸和迷迭香酸都對(duì)致病性大腸桿菌表現(xiàn)高度敏感，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)型大腸桿菌表現(xiàn)中度敏感；迷迭香油和丁香油對(duì)標(biāo)準(zhǔn)型大腸桿菌的抑制作用均明顯大于對(duì)致病性大腸桿菌的抑制作用；八角茴香油對(duì)兩種大腸桿菌的抑制作用相差不明顯。幾種提取物對(duì)標(biāo)準(zhǔn)型大腸桿菌的抑菌效果依次為：丁香油＞鼠尾草酸＞迷迭香油＞迷迭香酸＞八角茴香油，最大抑菌圈達(dá)20mm；對(duì)臨床型大腸桿菌的抑菌效果依次為：鼠尾草酸＞迷迭香酸＞八角茴香油＞迷迭香油＞丁香油，最大抑菌圈達(dá)19 mm。

3 討論

3．1 本試驗(yàn)用現(xiàn)代中藥提取、分析技術(shù)，對(duì)幾種中藥提取物抑制大腸桿菌的作用進(jìn)行了體外試驗(yàn)，具有工藝穩(wěn)定、有效成分含量明確、質(zhì)量可控的特點(diǎn)；本試驗(yàn)表明，迷迭香酸、鼠尾草酸、迷迭香油、丁香油和八角茴香油均有較強(qiáng)的體外抑制大腸桿菌作用。

3．2 由于中藥成分復(fù)雜，抗感染療效主要以增加機(jī)體免疫力為途徑，因此目前中藥抑菌作用的研究方面還存在試驗(yàn)操作缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)、體內(nèi)體外試驗(yàn)結(jié)果不一致和作用機(jī)制探討不深等問(wèn)題［10－12］。今后應(yīng)進(jìn)一步借助現(xiàn)代先進(jìn)的工藝和分析方法，加強(qiáng)對(duì)中藥抗感染藥物的正確認(rèn)識(shí)，深入探討中藥作為抗感染治療和消除細(xì)菌耐藥性的作用途徑和作用效果。

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