短期內(nèi)進(jìn)行牛型結(jié)核分支桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)復(fù)檢試驗(yàn)的結(jié)果變化觀察

王忠山，鄧紅江，劉向鵬，吳 挺，張子榮，崔 蕾，馬長賓，高永維

（1．新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)六師五家渠市畜牧獸醫(yī)工作站，新疆 五家渠831300；2．新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)一師畜牧獸醫(yī)工作站，新疆 阿克蘇843000）

牛型結(jié)核分支桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)，是當(dāng)前國際國內(nèi)普遍使用的牛結(jié)核病診斷方法。我國農(nóng)業(yè)部《牛結(jié)核病防治技術(shù)規(guī)范》將牛型結(jié)核分支桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)規(guī)定為牛結(jié)核病確診方法之一。GB／T 18645－2002（《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)》）規(guī)定，用牛型結(jié)核分支桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)檢出的結(jié)核病可疑牛，應(yīng)立即在對側(cè)頸部用同一批號試劑再進(jìn)行一次試驗(yàn)。在實(shí)際生產(chǎn)中，因?yàn)闄z出結(jié)核病陽性牛必須撲殺，為慎重，除可疑牛外，

多數(shù)情況下陽性牛也同時(shí)進(jìn)行了再次試驗(yàn)（復(fù)檢）以再次確認(rèn)。根據(jù)往年檢測結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)這種短期內(nèi)復(fù)檢通常都可弱化首次試驗(yàn)結(jié)果。為研究這種變化發(fā)生的原因及評價(jià)其對檢測結(jié)果判定的影響，

2012年我們對新疆南疆阿克蘇地區(qū)的4個(gè)奶牛場和北疆昌吉地區(qū)的1個(gè)奶牛場使用該方法進(jìn)行結(jié)核病檢測的情況進(jìn)行了觀察分析。

1 試驗(yàn)概況

1．1 牛群狀況 阿克蘇地區(qū)4個(gè)奶牛場牛群由各年齡段牛組成，昌吉地區(qū)1個(gè)奶牛場牛群由1．5～2歲后備奶牛組成。

1．2 試驗(yàn)試劑 提純結(jié)核菌素（牛型結(jié)核菌素C68001株、C68002株），哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司生產(chǎn)，批號：201007。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 試驗(yàn)操作 按照 GB／T 18645－2002（《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)》）中的牛型結(jié)核分支桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)進(jìn)行操作。被檢牛頸部上1／3剪毛，用卡尺測量皮皺厚度，75%酒精消毒術(shù)部，皮內(nèi)注射結(jié)核菌素0．1mL（含2 000IU），術(shù)后72h觀察結(jié)果，可疑和陰性牛于96h、120h再觀察1次。

1．3．2 結(jié)果判定 通過測量術(shù)部皮皺厚度結(jié)合觀察術(shù)部是否有炎性反應(yīng)、觸摸是否有結(jié)節(jié)判定結(jié)果。

局部有明顯的炎性反應(yīng)，皮厚差大于或等于4．0 mm，判為陽性；局部炎性反應(yīng)不明顯，皮厚差大于或等于2．0mm、小于4．0mm，判為可疑；無炎性反應(yīng)，皮厚差在2．0mm以下，判為陰性。

1．4 試驗(yàn)要求 牛場根據(jù)本場生產(chǎn)情況自行確定檢測時(shí)間和年檢測次數(shù)。對首次試驗(yàn)陽性和可疑牛進(jìn)行隔離并立即在對側(cè)頸部進(jìn)行復(fù)檢試驗(yàn)；觀察牛場牛群檢測試驗(yàn)均使用同一廠家、同一批號牛型結(jié)核菌素，每個(gè)牛場固定專人進(jìn)行結(jié)核菌素注射和皮厚測量。

1．5 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

1．5．1 將阿克蘇地區(qū)4個(gè)奶牛場分別編號為Ⅰ號、Ⅱ號、Ⅲ號、Ⅳ號，昌吉地區(qū)奶牛場編號為Ⅴ號，將皮厚測量誤差設(shè)為±0．5mm（測量皮厚人員10次測試確定的誤差值）。

1．5．2 統(tǒng)計(jì)不同牛場、不同試驗(yàn)時(shí)間（4月、10月）陽性和可疑牛復(fù)檢試驗(yàn)后結(jié)果變?yōu)殛栃浴⒖梢?、陰性的牛頭數(shù)，對應(yīng)計(jì)入統(tǒng)計(jì)表（見表1、表2）。

1．5．3 對試驗(yàn)檢出的陽性和可疑牛，計(jì)算首次試驗(yàn)皮厚差和復(fù)檢試驗(yàn)皮厚差之差（用P表示），分別統(tǒng)計(jì)P＞0．5mm、－0．5mm≤P≤0．5mm、P＜－0．5 mm牛頭數(shù)，按其對應(yīng)的牛場號和試驗(yàn)時(shí)間計(jì)入統(tǒng)計(jì)表（見表3）。

2 結(jié)果

2012年，Ⅰ號、Ⅱ號、Ⅲ號、Ⅳ號奶牛場分別在4月份和10月份各進(jìn)行了一次檢測，Ⅴ號奶牛場只在10月份進(jìn)行了一次檢測。

2．1 首次試驗(yàn)檢出陽性牛經(jīng)復(fù)檢試驗(yàn)后結(jié)果變化情況統(tǒng)計(jì)，見表1。

表1 首次試驗(yàn)檢出陽性牛經(jīng)復(fù)檢試驗(yàn)后結(jié)果變化情況統(tǒng)計(jì)

2．2 首次試驗(yàn)檢出可疑牛經(jīng)復(fù)檢試驗(yàn)后結(jié)果變化情況統(tǒng)計(jì)，見表2。

表2 首次試驗(yàn)檢出可疑牛經(jīng)復(fù)檢試驗(yàn)后結(jié)果變化情況統(tǒng)計(jì)

2．3 首次試驗(yàn)檢出的陽性和可疑牛，首次試驗(yàn)與復(fù)檢試驗(yàn)皮厚差變化情況統(tǒng)計(jì)，見表3。

3 結(jié)果

3．1 表1顯示，5個(gè)牛場不同時(shí)間內(nèi)用牛型結(jié)核分支桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)檢測，首次檢出的23頭陽性奶牛，立即用同一方法進(jìn)行復(fù)檢試驗(yàn)，0頭仍為陽性（0%），5頭轉(zhuǎn)為可疑（21．7%），18頭轉(zhuǎn)為陰性（78．3%）；表3顯示，編號為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的5個(gè)牛場不同時(shí)間內(nèi)用牛型結(jié)核分支桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)檢測，首次試驗(yàn)檢出的71頭可疑牛，經(jīng)復(fù)檢試驗(yàn)，0頭轉(zhuǎn)為陽性（0%），14頭仍為可疑（19．7%），57頭轉(zhuǎn)為陰性（80．3%）；對不同牛場各月份檢測試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)一呈現(xiàn)復(fù)檢試驗(yàn)結(jié)果較首次試驗(yàn)結(jié)果變?nèi)醯内厔?；對照檢測原始記錄數(shù)據(jù)，對首次試驗(yàn)可疑復(fù)檢試驗(yàn)仍為可疑的14頭奶牛的皮厚差變化分析，有8頭牛皮厚差變化基本維持不變（－0．5mm≤P≤0．5mm），有6頭皮厚差較前次試驗(yàn)減小（P＞0．5mm），所占比例分別為：57．1%和42．9%，復(fù)檢試驗(yàn)無皮厚差增大牛。以上結(jié)果表明，用牛型結(jié)核分支桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)進(jìn)行奶牛結(jié)核病檢測，首次試驗(yàn)后立即進(jìn)行復(fù)檢試驗(yàn)，除部分牛維持與前次試驗(yàn)相同結(jié)果外，多數(shù)陽性和可疑牛的復(fù)檢結(jié)果呈現(xiàn)弱化趨勢。

表3 首次試驗(yàn)與復(fù)檢試驗(yàn)皮厚差變化情況統(tǒng)計(jì)

3．2 表3顯示，5個(gè)牛場不同時(shí)間內(nèi)用牛型結(jié)核分支桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)檢測，首次試驗(yàn)共檢出陽性和可疑牛94頭，立即進(jìn)行復(fù)檢試驗(yàn)，有82頭皮厚差較首次試驗(yàn)變小（P＞0．5mm），占87．2%，11頭維持不變（－0．5mm≤P≤0．5mm），占11．7%，有1頭皮厚差增大（P＜－0．5mm），占1．1%。統(tǒng)計(jì)分析不同試驗(yàn)時(shí)間（4月、10月）、不同牛場、不同地域（南疆、北疆）試驗(yàn)結(jié)果，復(fù)檢試驗(yàn)后皮厚差變小的牛頭數(shù)都呈明顯增加趨勢。這一結(jié)果表明，首次試驗(yàn)后立即進(jìn)行再次試驗(yàn)，87．2%的牛變態(tài)反應(yīng)受到了抑制，11．7%的牛基本維持不變，1．1%的牛出現(xiàn)增強(qiáng)。

用牛型結(jié)核分支桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)診斷奶牛結(jié)核病，對試驗(yàn)檢出的陽性和可疑牛立即用該方法進(jìn)行復(fù)檢試驗(yàn)檢測，多數(shù)牛（87．2%）的變態(tài)反應(yīng)會(huì)受到抑制，導(dǎo)致復(fù)檢試驗(yàn)弱化了前次試驗(yàn)的結(jié)果。

4 討論

由于牛型結(jié)核分支桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)具有便于野外作業(yè)、價(jià)格低廉、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前最常用的牛結(jié)核病診斷方法，但該方法檢出的陽性牛中，經(jīng)常有部分牛被剖檢或其他試驗(yàn)證明為假陽性，因此也被證明該方法存在非特異性。GB／T 18645－2002規(guī)定，對該試驗(yàn)檢出的可疑牛立即實(shí)施復(fù)檢，其目的是通過再次試驗(yàn)盡可能消除這種非特異性，以再次確認(rèn)可疑牛。本文觀察結(jié)果表明，這種短時(shí)間內(nèi)實(shí)施復(fù)檢試驗(yàn)的方法，由于復(fù)檢試驗(yàn)中多數(shù)牛的變態(tài)反應(yīng)會(huì)受到抑制，易導(dǎo)致錯(cuò)誤診斷。

通過試驗(yàn)診斷牛結(jié)核病的主要目的是檢出陽性牛進(jìn)行撲殺并無害化處理，以凈化牛群、控制傳染。筆者認(rèn)為，由于各地條件不同，應(yīng)根據(jù)自身?xiàng)l件確定檢測診斷方案。在試驗(yàn)條件較好的地區(qū)，應(yīng)將該試驗(yàn)方法作為初篩的主要手段，對檢出的陽性和可疑牛通過其他特異性較高的方法進(jìn)行進(jìn)一步確診，以達(dá)到不漏判陽性牛和不錯(cuò)判陽性牛的目的；而在實(shí)驗(yàn)室檢測條件較差的地區(qū)，則仍需以此方法做為主要的檢測手段，在結(jié)果處理上，應(yīng)遵循以下原則：（1）對試驗(yàn)檢出的陽性牛不再復(fù)檢，直接撲殺；（2）對試驗(yàn)檢出的可疑牛應(yīng)隔離飼養(yǎng)一段時(shí)間后再進(jìn)行復(fù)檢，而不宜立即復(fù)檢。γ－干擾素檢測法是一種靈敏度和特異性較高的檢測方法［1］，IFN－γ檢測法在國外一些國家已做為一種標(biāo)準(zhǔn)方法應(yīng)用，國內(nèi)一些地區(qū)也已將該方法用于結(jié)核病牛的確診，但目前尚未將該方法列入國家標(biāo)準(zhǔn)；關(guān)于牛型結(jié)核分支桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)可疑牛的復(fù)檢時(shí)間問題，《牛結(jié)核病防治技術(shù)規(guī)范》規(guī)定為42d，GB／T 18645－2002規(guī)定為60d，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，結(jié)核菌素試驗(yàn)在60d內(nèi)可限制接下來的試驗(yàn)［2］，因此，間隔60d以上進(jìn)行復(fù)檢試驗(yàn)較為合適。

［1］ Amadori M ，Konstantinp L ，Matilak G．Use of recombinant proteins in antibody tests for bovine tuberculosis［J］．J Vet Microbiology，2002，85：379－389．

［2］ Radunz B L，Lepper A W D．Suppression of skin reactivity to bovine tuberculin in repeat test［J］．Austr Vet J，1985，62：191－194．